Genetičko mapiranje. Strategija genetskog mapiranja i njegova uloga u identifikaciji novih gena nasljednih bolesti Primjeri genetskog mapiranja gena ljudskih bolesti
Alfred Sturtevant (Morganov saradnik) sugerira da učestalost ukrštanja između gena koji se nalaze na istom hromozomu može poslužiti kao mjera udaljenosti između gena. Drugim riječima, učestalost ukrštanja, izražena kao odnos broja ukrštenih jedinki i ukupnog broja jedinki, izravno je proporcionalna udaljenost između gena. Učestalost ukrštanja može se zatim koristiti za određivanje relativnog položaja gena i udaljenosti između gena.
Genetsko mapiranje je određivanje položaja gena u odnosu na (barem) dva druga gena. Konstantnost procenta ukrštanja između određenih gena omogućava im lokalizaciju. Jedinica udaljenosti između gena je 1% prelaska; u čast Morgana, zove se ova jedinica morganida (M) ili santimorganide (CM).
U prvoj fazi mapiranja potrebno je utvrditi pripadnost gena veznoj grupi. Što je više gena poznato u određenoj vrsti, to su rezultati mapiranja tačniji. Svi su geni podijeljeni u grupe veza.
Broj vezanih grupa odgovara haploidnom skupu hromozoma. Na primjer, u D. melanogaster 4 grupe kvačila, kukuruz 10, miševi 20, ljudi 23 grupe kvačila. Ako postoje spolni hromozomi, oni su dodatno naznačeni (na primjer, osoba ima 23 grupe veza i Y hromozom).
Broj gena u veznim skupinama u pravilu ovisi o linearnim dimenzijama odgovarajućih hromozoma. Dakle, voćna muha ima jedan (IV) tačka (kada se analizira pod svjetlosnim mikroskopom) hromozom. U skladu s tim, broj gena u njemu je višestruko manji nego u ostalim, što ga znatno premašuje po dužini. Također treba napomenuti da u heterokromatskim regijama hromozoma geni odsutni ili gotovo odsutni, stoga proširena područja konstitutivnog heterokromatina mogu donekle promijeniti proporcionalnost broja gena i dužinu hromozoma.
Na osnovu genetskog mapiranja izrađuju se genetske karte. Na genetskim mapama ekstremni gen (tj. Onaj koji je najudaljeniji od centromere) odgovara nultoj (početnoj) točki. Udaljenost gena od nulte tačke naznačena je kod morganida.
Ako su hromozomi dovoljno dugi, tada uklanjanje gena s nulte točke može premašiti 50 M - tada postoji kontradikcija između udaljenosti označenih na karti, koja prelaze 50%, i gore postavljene pozicije, prema kojoj bi 50% ukrštenih križanja dobivenih u eksperimentu zapravo trebalo značiti odsustvo veze. tj. e. lokalizacija gena u različitim hromozomima. Ova kontradikcija se objašnjava činjenicom da se prilikom sastavljanja genetičkih karata sumiraju udaljenosti između dva najbliža gena, što premašuje eksperimentalno uočeni procenat ukrštanja.
KAZAKSKO NACIONALNO SVEUČILIŠTE IMENOVANO PO AL-FARABIJU
Fakultet: biologija i biotehnologija
Odjel: biotehnologija
"ESSAY"
Na temu: GENETSKO SPOJANJE I KARTIRANJE LJUDSKIH GENA.
Završeno : 3-godišnji studenti (medicinski bt.)
Nuralibekov S.Sh.
Davronova M.A.
Provjereno : ph.D. , vanredni profesor na katedrimolekularni
biologija i genetika Omirbekova N.Zh.
ALMATY 2018
Mape genetske povezanosti ……………………………………………………… ..3
Savremene metode za izgradnju mapa genetske povezanosti …… .......... …… ...… .5
PCR u studijama humanog genoma ……………………………… .... …………. …… 8
Fizičke mape niske rezolucije ………………………………………… ..….… .9
Fizičke mape visoke rezolucije …………… .. ……………………… .. ……… 11
Popis korištenih izvora ……………… ... …………… .. ………………… .13
Mapiranje i određivanje primarne strukture ljudskog genoma
Nakon kratkog pregleda glavnih metoda koje se najčešće koriste u molekularnoj genetici za proučavanje strukture i mehanizama funkcioniranja gena, čini se korisnim detaljnije proučiti praktičnu primjenu ovih metoda i njihove modifikacije za proučavanje velikih genoma na primjeru ljudskog genoma. Kako bi se sveobuhvatno proučavao ljudski genom, ovo ogromno skladište njegovih genetičkih informacija, nedavno je razvijen i provodi se poseban međunarodni program "Projekt ljudskog genoma". Glavni zadatak programa je izgradnja sveobuhvatnih genetskih karata visoke rezolucije za svaki od 24 ljudska hromozoma, koja bi, u konačnici, trebala završiti određivanjem kompletne primarne strukture DNK ovih hromozoma. Trenutno je rad na projektu u punom jeku. U slučaju njegovog uspješnog završetka (a to bi se prema planovima trebalo dogoditi 2003. godine), čovječanstvo će imati perspektivu za temeljito proučavanje funkcionalnog značaja i mehanizama funkcioniranja svakog od svojih gena, kao i genetskih mehanizama koji upravljaju ljudskom biologijom, te utvrđivanje uzroka većine patoloških stanja svog tijela ...
Osnovni pristupi mapiranju ljudskog genoma
Rješenje glavnog zadatka programa Ljudski genom uključuje tri glavne faze. U prvoj fazi potrebno je odvojiti svaki pojedinačni hromozom na specifičan način na manje dijelove, omogućavajući njihovu daljnju analizu poznatim metodama. Druga faza istraživanja uključuje određivanje relativnog položaja ovih pojedinačnih fragmenata DNK jedan prema drugom i njihovu lokalizaciju u samim hromozomima. U završnoj fazi potrebno je izvršiti stvarno određivanje primarne strukture DNK za svaki od karakteriziranih fragmenata hromozoma i sastaviti cjelovitu kontinuiranu sekvencu njihovih nukleotida. Rješenje problema neće biti potpuno ako u pronađenim nukleotidnim sekvencama nije moguće lokalizirati sve gene organizma i utvrditi njihov funkcionalni značaj. Prolazak gore navedene tri faze potreban je ne samo za dobivanje sveobuhvatnih karakteristika ljudskog genoma, već i bilo kojeg drugog velikog genoma.
Mape genetske povezanosti
Mape genetske povezanosti jednodimenzionalni su obrasci međusobnog rasporeda genetskih markera na pojedinačnim hromozomima. Pod genetskim markerima se podrazumijevaju bilo koja naslijeđena fenotipska svojstva koja se razlikuju kod pojedinih jedinki. Fenotipska svojstva koja udovoljavaju zahtjevima genetskih markera vrlo su raznolika. Uključuju i svojstva ponašanja ili predispoziciju za određene bolesti, i morfološke znakove cijelih organizama ili njihovih makromolekula, koji se razlikuju u strukturi. Razvojem jednostavnih i efikasnih metoda za proučavanje bioloških makromolekula, takve osobine, poznate kao molekularni markeri, postale su najčešće korištene u izradi mapa genetske povezanosti. Prije nego što prijeđemo na razmatranje metoda za izgradnju takvih karata i njihovih implikacija na proučavanje genoma, potrebno je podsjetiti da se pojam "povezanost" koristi u genetici da označi vjerovatnoću zajedničkog prijenosa dviju osobina s jednog roditelja na potomstvo.
Tokom stvaranja zametnih ćelija (spolnih ćelija) kod životinja i biljaka u stadiju mejoze, u pravilu se javlja sinapsa (konjugacija) homoloških hromozoma. Sestrinske kromatide homolognih hromozoma povezane su cijelom dužinom međusobno, a kao rezultat križanja (genetska rekombinacija između kromatida) njihovi se dijelovi zamjenjuju. Što se dva genetska biljega dalje nalaze jedan na drugom na hromatidi, to je vjerojatnije da će se među njima dogoditi puknuće hromatide potrebno za prelazak, a dva markera u novom hromozomu koji pripadaju novoj spolnoj stanici bit će odvojena jedan od drugog, tj. njihova kohezija će biti prekinuta. Jedinica povezivanja genetskih markera je morganida (Morganova jedinica, M), koja sadrži 100 centimetara (cM). 1 cM odgovara fizičkoj udaljenosti na genetskoj mapi između dva markera, čija se rekombinacija javlja s frekvencijom od 1%. Izraženo u osnovnim parovima, 1 cM odgovara 1 milion bp. (talište) DNK.
Mape genetske povezanosti tačno odražavaju redoslijed smještaja genetičkih markera na hromozomima, ali dobivene vrijednosti udaljenosti između njih ne odgovaraju stvarnim fizičkim udaljenostima. Obično je ova činjenica povezana s činjenicom da efikasnost rekombinacije između hromatida u pojedinim regijama hromozoma može uvelike varirati. Konkretno, suzbija se u heterokromatskim regijama hromozoma. S druge strane, žarišta rekombinacije česta su u hromozomima. Upotreba frekvencija rekombinacije za izgradnju fizičkih genetičkih karata bez uzimanja u obzir ovih faktora dovešće do iskrivljenja (odnosno potcjenjivanja ili precjenjivanja) stvarne udaljenosti između genetičkih markera. Prema tome, genetske karte povezanosti najmanje su precizne od svih dostupnih vrsta genetskih karata i mogu se smatrati samo prvom aproksimacijom stvarnih fizičkih karata. Ipak, u praksi upravo oni i samo oni omogućuju lokaliziranje složenih genetskih markera (na primjer povezanih sa simptomima bolesti) u prvim fazama studije i omogućavaju njihovo daljnje proučavanje. Mora se imati na umu da bi u odsustvu ukrštanja svi geni na pojedinačnom hromozomu bili prenošeni s roditelja na potomstvo, budući da su fizički povezani jedni s drugima. Stoga pojedinačni hromozomi čine vezne grupe gena, a jedan od prvih zadataka konstruiranja genetičkih mapa povezivanja je dodijeljivanje proučavanog niza gena ili nukleotida određenoj veznoj grupi. U sledećem. U tablici su navedene savremene metode koje su, prema V.A. McCusick su se najčešće koristili za izgradnju mapa genetske povezanosti do kraja 1990.
Savremene metode za izgradnju mapa genetske povezanosti
| Metoda | Broj mapiranih lokusa |
| Hibridizacija somatskih ćelija | 1148 |
| In situ hibridizacija | 687 |
| Porodica | 466 |
| Određivanje efekta doze | 159 |
| Mapiranje ograničenja | 176 |
| Upotreba hromozomskih aberacija | 123 |
| Korišćenje sintenije | 110 |
| Segregacija gena izazvana zračenjem | 18 |
| Ostale metode | 143 |
| Ukupno | 3030 |
Hibridizacija somatskih ćelija. Jedna od najpopularnijih metoda za dodjeljivanje genetskog markera (funkcionalno aktivnog gena) određenoj poveznoj grupi je hibridizacija (međusobna fuzija) somatskih ćelija različitih bioloških vrsta organizama, od kojih je jedna proučavana. U interspecifičnim hibridima somatskih ćelija u procesu kultivacije dolazi do gubitka hromozoma, uglavnom jedne od bioloških vrsta. Gubitak hromozoma je u pravilu slučajan, a rezultirajući klonovi ćelija sadrže preostale hromozome u različitim kombinacijama. Analiza klonova koji sadrže različite skupove hromozoma vrste koja se proučava omogućava nam da utvrdimo sa kojim od ovih preostalih hromozoma je povezana ekspresija proučavanog markera i, prema tome, da lokaliziramo gen na određenom hromozomu.
In situ hibridizacija. Tehnika hibridizacije in situ takođe se široko koristi za mapiranje nukleotidnih sekvenci na hromozomima. U tu svrhu pripravci fiksnih hromozoma hibridiziraju se (inkubiraju na povišenoj temperaturi praćenom hlađenjem) sa nukleotidnim sekvencama u ispitivanju koje su označene radioaktivnom, fluorescentnom ili drugom oznakom. Nakon ispiranja nevezane oznake, preostali obilježeni molekuli nukleinske kiseline povezani su s regionima hromozoma koji sadrže sekvence komplementarne proučavanim obilježenim nukleotidnim sekvencama. Dobijeni hibridi se analiziraju mikroskopom direktno ili nakon autoradiografije. Ovu skupinu metoda karakterizira veća rezolucija od hibridizacije somatskih ćelija, jer omogućavaju lokalizaciju proučavanih nukleotidnih sekvenci na hromozomima. Kako program za ljudski genom napreduje, istraživači imaju sve više izoliranih nukleotidnih sekvenci koje se mogu koristiti kao sonde za in situ hibridizaciju. S tim u vezi, ove su metode čvrsto na prvom mjestu po učestalosti upotrebe. Najpopularnija je grupa metoda koja se naziva fluorescentna in situ hibridizacija (FISH), a koja koristi polinukleotidne sonde koje sadrže fluorescentnu oznaku. Konkretno, 1996. godine objavljeno je\u003e 600 radova koji opisuju upotrebu ove metode.
Analiza porodične genetske povezanosti. Ova grupa metoda često se koristi u medicinskoj genetici za utvrđivanje veze (povezanosti) između simptoma bolesti uzrokovanih mutacijom nepoznatog gena i drugih genetskih markera. U ovom slučaju, sami simptomi bolesti djeluju kao jedan od genetskih markera. Veliki broj polimorfizama, uključujući RFLP, pronađen je u ljudskom genomu. RFLP se distribuiraju manje-više ravnomjerno u ljudskom genomu na međusobnoj udaljenosti od 5-10 cm. Što se pojedinačni polimorfni lokusi nalaze bliže genu koji je odgovoran za bolest, to je manja vjerovatnoća da će biti razdvojeni tijekom rekombinacije u mejozi i češće će se pojaviti zajedno u bolesne jedinke i zajedno prenijeti s roditelja na potomstvo. Nakon kloniranja proširene regije genoma, uključujući odgovarajući polimorfni marker (njegov odabir iz biblioteke genomskih DNK klonova vrši se pomoću sonde), moguće je istovremeno izolirati gen koji uzrokuje nasljednu bolest zajedno s njim. Takvi pristupi su se posebno uspješno primijenili za porodičnu analizu i izolaciju odgovarajućih gena u Duchenneovoj mišićnoj distrofiji, cističnoj fibrozi bubrega (cistična fibroza) i miotoničnoj distrofiji. Informativna vrijednost pojedinačnih RFLP-a ljudskog genoma ovisi o nivou njihove heterozigotnosti u proučavanoj populaciji. Mjerom informativnosti RFLP-a kao genetskog markera, kako sugerira D. Botstein i suradnici (1980), smatra se vrijednost sadržaja informacija o polimorfizmu (PIC), što je omjer broja ukrštanja na kojima barem jedan od roditelja ima proučeni polimorfni marker u heterozigotnom stanju, na sve križeve.
Određivanje efekta doze gena i upotreba hromozomskih aberacija ... Ove metode otkrivaju korelacije između nivoa ekspresije ispitivanog gena i broja specifičnih hromozoma u aneuploidnim ćelijskim linijama ili strukturnih preuređenja hromozoma (hromozomske mutacije - aberacije). Aneuploidija je prisustvo određenog broja hromozoma u ćeliji, tkivu ili čitavom organizmu, što nije jednako onom tipičnom za datu biološku vrstu. Kromosomske aberacije u obliku translokacija regija hromozoma u heterokromatske regije istog ili drugih hromozoma često su praćene suzbijanjem transkripcije gena koji se nalaze u premeštenim regijama ili u akceptorskom hromozomu (mozaični efekat položaja).
Korišćenje sintenije. Sintenija je strukturna sličnost grupa vezanih gena u organizmima različitih bioloških vrsta. Konkretno, nekoliko desetina sintetičkih grupa gena poznato je u genomu čovjeka i miša. Prisustvo fenomena sintenije omogućava sužavanje potrage za lokalizacijom ispitivanog gena na hromozomima, ograničavajući ga na područje poznatih gena koji pripadaju određenoj sintetskoj grupi.
Segregacija gena indukovana jonizujućim zračenjem. Koristeći ovu metodu, udaljenost između gena koji se proučavaju određuje se procenom verovatnoće njihovog razdvajanja (segregacije) nakon zračenja ćelija određenom standardnom dozom jonizujućeg zračenja. Ozračene ćelije se od smrti spašavaju hibridizacijom sa somatskim ćelijama glodara, a prisustvo proučavanih markera ozračenih ćelija utvrđuje se kod somatskih hibrida u kulturi. Kao rezultat, moguće je zaključiti o prisutnosti ili odsustvu veze (fizičke udaljenosti) između ovih gena.
Među druge metode Treba spomenuti metode zasnovane na upotrebi velikih fragmenata DNA generiranih restrikcijskim enzimima velikog cijepanja za mapiranje gena. Nakon cijepanja genomske DNA, rezultirajući fragmenti se odvajaju elektroforezom u impulsnom električnom polju, a zatim se hibridiziraju prema Southern-u sondama koje odgovaraju mapiranim genima. Ako su nakon hibridizacije signali obje sonde lokalizirani na istom velikom fragmentu DNA, to ukazuje na usku vezu takvih gena.
PCR u studijama humanog genoma
Lančana reakcija polimeraze ključna je za razvoj pristupa praktičnoj provedbi Programa za ljudski genom. Kao što je gore spomenuto, pomoću PCR-a moguće je brzo i efikasno pojačati gotovo bilo koju kratku regiju ljudskog genoma, a dobiveni PCR proizvodi mogu se zatim koristiti kao sonde za mapiranje odgovarajućih regija na hromozomima Southern-ovom hibridizacijom ili in situ.
STS koncept. Jedan od ključnih koncepata koji leži u osnovi mapiranja ljudskih gena u okviru razmatranog programa je koncept lokacija označenih sekvencama (STS). U skladu s ovim konceptom, svi fragmenti DNK koji se koriste za izgradnju genetskih ili fizičkih mapa mogu se jedinstveno identificirati pomoću nukleotidne sekvence od 200-500 bp koja će biti jedinstvena za dati fragment. Svaka od ovih lokacija mora biti sekvencirana, što će omogućiti njihovo dodatno pojačavanje pomoću PCR-a i upotrebu kao sonde. Upotreba STS-a omogućila bi upotrebu njihovih sekvenci u obliku PCR proizvoda kao sondi za ciljanu izolaciju bilo kojeg fragmenta DNK određenog genomskog područja iz kolekcije genomskih sekvenci. Kao rezultat toga, mogu se stvoriti baze podataka koje uključuju lokalizaciju i strukturu svih STS-ova, kao i početnike potrebne za njihovo pojačavanje. To bi eliminiralo potrebu da laboratorije čuvaju brojne klonove i šalju ih u druge laboratorije na istraživanje. Pored toga, STS pružaju osnovu za razvoj jedinstvenog jezika na kojem bi različite laboratorije mogle opisati svoje klonove. Stoga bi krajnji rezultat razvoja koncepta STS-a bila sveobuhvatna mapa STS-a ljudskog genoma. Teoretski, za izgradnju genetske mape veličine 1 cm potrebno je 3000 potpuno informativnih, polimorfnih DNK markera. Međutim, budući da su polimorfni biljezi neravnomjerno raspoređeni u genomu i samo je nekoliko njih potpuno informativan, stvarni broj markera potrebnih za izgradnju mape ove veličine procjenjuje se na 30-50 tisuća. Za dobivanje markera koji odgovaraju regijama hromozoma koji se proučavaju, često se koriste početnici koji odgovaraju dispergovanim ponavljajućim sekvencama, među kojima su prvo korišćene Alu sekvence.
Alu-PCR.Raspršene ponovljene Alu sekvence karakteristične su za ljudski genom. Primeri specifični za Alu sekvence koriste se za pojačavanje DNK regija ljudskog genoma zatvorenih između ponavljanja Alu, koje se u prosjeku nalaze na udaljenosti od 4-10 kb. odvojeno. Druga opcija za Alu-PCR usmjerena je sinteza DNK sondi uz pomoć regija hromozoma dobivenih nakon laserske fragmentacije, pojedinačnih hromozoma izoliranih protočnom citometrijom ili DNK hibridnih ćelija koje sadrže određeni dio ljudskog genoma. Pored toga, Alu-PCR se koristi za dobivanje jedinstvenih otisaka prstiju koji karakteriziraju ćelijske hibride u smislu njihove stabilnosti genoma, kao i za karakterizaciju fragmenata ljudske DNK kloniranih u YAC vektore, kosmide ili vektore na bazi DNK bakteriofaga. Jedinstvenost Alu sekvenci za ljudski genom omogućava njihovu upotrebu za „hodanje duž hromozoma“, kao i za proširivanje postojećih kontiga. Budući da\u003e 90% umjereno ponavljajućih sekvenci u ljudskom genomu predstavljaju porodice Alu i KpnI, nije iznenađujuće da se potonje također koriste u PCR-u u iste svrhe kao i Alu. Međutim, ovdje su profili PCR proizvoda manje složeni, jer se sekvence KpnI rjeđe ponavljaju u genomu i imaju karakterističnu lokalizaciju u hromozomima.
PCR se aktivno koristi za identifikaciju polimorfnih molekularnih markera prilikom izrade mapa genetske povezanosti, o čijim su osnovnim principima prethodno bilo riječi. Ova metoda je takođe korisna u sekvenciranju DNK, kao i u izgradnji fizičkih mapa visoke rezolucije za ljudski genom. Posljednja dva područja primjene PCR-a bit će detaljnije obrađena u nastavku.
Fizičke mape niske rezolucije
Za razliku od gore spomenutih mapa genetske povezanosti, fizičke mape genoma odražavaju stvarnu udaljenost između markera, izraženu u baznim parovima. Fizičke karte razlikuju se po stepenu svoje razlučivosti, tj. na detaljima strukture genoma koji su na njima predstavljeni. Sveobuhvatna fizička mapa ljudskog genoma maksimalne rezolucije sadržavat će kompletnu nukleotidnu sekvencu svih njegovih hromozoma. Druga krajnost fizičkih mapa s minimalnom rezolucijom su hromozomske (citogenetske) mape genoma.
Četiri vrste genetičkih mapa genomske DNA i njihov odnos
1 - karta genetske povezanosti, 2 - karta fizičke restrikcije, razmaci označavaju mjesta cijepanja DNK restrikcijskim enzimima, 3 - fizička karta kontigova, koja prikazuje preklapajuće se DNK klonove dobivene pomoću YAC vektora, 4 - sveobuhvatna fizička karta u obliku DNA sekvence nukleotida. Sve mape pokazuju isto područje hromozoma
Mape kromosoma. Mape hromozoma ljudskog genoma dobijaju se lokalizacijom genetskih markera na pojedinačnim hromozomima citogenetskim metodama, uključujući autoradiografiju i FISH. U posljednja dva slučaja radioaktivne ili fluorescentne oznake povezane sa proučavanim genetskim lokusima netaknutih hromozoma otkrivaju se svjetlosnom mikroskopijom. Ne tako davno, mape hromozoma omogućile su lokalizaciju proučavanog fragmenta DNK na hromozomu dužine 10 mp. Savremene metode hibridizacije in situ pomoću metafaznih hromozoma, uglavnom FISH metoda, lokalizuju polinukleotidne markere unutar 2–5 bp. Štoviše, tijekom hibridizacije in situ s interfaznim hromozomima, u kojoj je genetski materijal u manje kompaktnom obliku, razlučivost mapa hromozoma se približava 100 kbp.
Tačnost mapa hromozoma poboljšana je i upotrebom modernih genetskih metoda. Na primjer, sposobnost PCR-a da umnoži segmente DNK jedne ćelije sperme omogućava proučavanje velikog broja mejoza, sačuvanih u pojedinačnim uzorcima sperme. Kao rezultat toga, postaje moguće provjeriti relativni položaj genetskih markera lokaliziranih na kartama hromozoma koristeći sirovije metode.
CDNA mape... CDNA mape odražavaju položaj eksprimiranih DNK regija (egzona) u odnosu na poznate citogenetske markere (trake) na metafaznim hromozomima. Budući da takve mape pružaju ideju o lokalizaciji prepisanih regija genoma, uključujući gene s nepoznatim funkcijama, mogu se koristiti za traženje novih gena. Ovaj pristup je posebno koristan u potrazi za genima čija oštećenja uzrokuju ljudske bolesti, ako je približna lokalizacija takvih područja hromozoma već izvršena na mapama genetičkih veza kao rezultat porodične genetske analize.
Fizičke mape visoke rezolucije
Dvije strategije za izgradnju fizičkih mapa DNK
a - strategija "odozgo prema dolje": DNK cijelog hromozoma cijepa se restrikcijskim enzimima velikog cijepanja, za svaki od pojedinačnih fragmenata DNK izgrađena je restrikcijska karta; b - strategija "odozdo prema gore", pojedinačni YAC klonovi se kombiniraju u kontigove nakon identifikacije
U pokušajima konstruiranja mapa humanog genoma visoke rezolucije eksperimentalno se primjenjuju dva alternativna pristupa, koja se nazivaju mapiranje odozgo prema dolje i mapiranje odozdo prema gore. Prilikom mapiranja od vrha do dna, početna analiza je DNK priprema pojedinačnog humanog hromozoma. DNK se reže restrikcijskim enzimima velikog cijepanja (npr. NotI) na duge fragmente, koji se nakon razdvajanja elektroforezom u impulsnom električnom polju podvrgavaju daljnjoj restrikcijskoj analizi s drugim restrikcijskim enzimima. Kao rezultat, dobiva se makrorestrikcijska karta na kojoj su sve sekvence proučavanog hromozoma ili njegovih dijelova dovoljno u potpunosti predstavljene, ali njegova razlučivost je niska. Na takvoj je karti vrlo teško lokalizirati pojedinačne gene. Pored toga, svaka pojedinačna karta rijetko pokriva proširene segmente DNA (u pravilu ne više od 1–10 mp).
Prilikom mapiranja ljudskog genoma odozdo prema gore, na osnovu pripreme ukupne DNK genoma ili pojedinačnog hromozoma, dobije se niz slučajnih klonova proširenih sekvenci DNK (10-1000 kb), od kojih se neki preklapaju. U ovom slučaju, umjetni mini-hromosomi bakterija (BAC) ili kvasca (YAC) često se koriste kao vektor za kloniranje, detaljno opisano u odjeljku 7.2.4. Niz djelimično preklapajućih i komplementarnih klonova tvore susjedni DNA nukleotidni niz nazvan contig. Ispravnost dobivenih kontigova potvrđuje se hibridizacijom in situ (FISH) uz njihovo istovremeno vezivanje za određene regije proučavanih hromozoma. Mape zasnovane na kontigu pružaju potpune informacije o strukturi pojedinih segmenata hromozoma i omogućavaju vam lokalizaciju pojedinih gena. Međutim, takve je mape teško koristiti za rekonstrukciju čitavih hromozoma ili njihovih proširenih odjeljaka zbog odsustva odgovarajućih klonova u postojećim klonskim bibliotekama gena.
Glavni problem koji se mora riješiti prilikom korištenja oba pristupa u konstrukciji fizičkih mapa visoke rezolucije je objedinjavanje raspršenih fragmenata DNK u susjedne nukleotidne sekvence. Za to se najčešće koriste posebni klonirani fragmenti DNK, koji se nazivaju povezujući klonovi. DNA fragmenti iz veznih klonova sadrže nukleotidne sekvence restrikcijskih endonukleaza velikog rascjepa u svojim unutrašnjim dijelovima i, prema tome, predstavljaju spojeve fragmenata DNA korištenih u prvim fazama fizičkog mapiranja. Južnjačkom hibridizacijom, tokom koje se DNK fragmenti veznih klonova koriste kao sonde, određuju se DNK fragmenti fizičkih mapa koje sadrže nukleotidne sekvence u blizini restrikcijskih mjesta restrikcijskih endonukleaza velikog rascjepa. Ako se pronađu dva takva fragmenta, odgovarajući klon za povezivanje preklapa oba ova fragmenta i dio je njih. Klonovi vezivanja se, pak, biraju iz genskih banaka pomoću sondi, koje su nukleotidne sekvence restriktivnih mjesta enzima restrikcije velikog cijepanja.
LISTA USED IZVORI
1) Clark M.S. Komparativna genomika: ključ za razumijevanje projekta humanog genoma // BioEssays. 1999. Vol. 21. P. 21-30.
2) Billings P.R., Smith C.L., Cantor C.L. Nove tehnike za fizičko mapiranje ljudskog genoma // FASEB J. 1991. Vol. 5. P. 28–34.
3) Georgiev G.P. Geni viših organizama i njihov izraz. Moskva: Nauka, 1989.254 str.
4) http://referatwork.ru/refs/source/ref-8543.html
Ubrzo nakon ponovnog otkrivanja Mendelovih zakona, njemački citolog Theodor Boveri (1902) iznio je dokaze o sudjelovanju hromozoma u procesima nasljednog prijenosa, pokazujući da je normalan razvoj morskog ježa moguć samo ako su prisutni svi hromozomi. Istodobno (1903.), američki citolog William Setton skrenuo je pažnju na paralelizam u ponašanju hromozoma u mejozi i hipotetičke faktore nasljednosti, čije je postojanje već predvidio sam Mendel.
William Setton sugerira da se na jednom hromozomu može naći nekoliko gena. U ovom slučaju treba promatrati povezano nasljeđivanje osobina, tj. može se naslijediti nekoliko različitih osobina kao da ih kontrolira jedan gen. 1906. W. Batson i R. Pennett otkrili su povezano nasljeđivanje slatkog graška. Proučavali su zajedničko nasljeđivanje: boje cvijeta (ljubičasta ili crvena) i oblike zrna peluda (izdužene ili okrugle). Prilikom ukrštanja diheterozigota, kod njihovog potomstva uočeno je cijepanje od 11,1: 0,9: 0,9: 3,1 umjesto očekivanih 9: 3: 3: 1. Činilo se da faktori polena u boji i obliku imaju tendenciju da ostanu zajedno tokom rekombinacije sklonosti. Autori su ovaj fenomen nazvali "uzajamnom privlačenjem faktora", ali nisu uspjeli otkriti njegovu prirodu.
Dalje proučavanje hromozoma kao nosača informacija odvijalo se u prvim decenijama dvadesetog veka u laboratoriju Tomasa Hunta Morgana (SAD) i njegovih saradnika (A. Sturtevant, C. Bridges, G. Möller). Morgan je koristio voćnu muhu Drosophila melanogaster kao svoj glavni predmet istraživanja, što se pokazalo vrlo pogodnim objektom modela:
- Prvo, ovu muhu je lako uzgajati u laboratorijskim uslovima.
- Drugo, karakterizira ga mali broj hromozoma (2 n \u003d 8).
- Treće, u pljuvačnim žlijezdama larvi Drosophila postoje gigantski (politenski) hromozomi koji su pogodni za direktno posmatranje.
- I, konačno, Drosophila se odlikuje velikom varijabilnošću morfoloških karakteristika.
Na osnovu eksperimenata sa voćnom muhom Drosophilom Morgan i njegovim učenicima, razvijena je hromozomska teorija nasljedstva.
Glavne odredbe hromozomske teorije nasljedstva:
1. Gene - Ovo je elementarni nasljedni faktor (pojam "elementarni" znači "nedjeljiv bez gubitka kvalitete"). Gen je dio hromozoma koji je odgovoran za razvoj određene osobine. Drugim riječima, geni se nalaze na hromozomima.
2. Jedan hromozom može sadržavati hiljade gena poredanih linearno (poput zrna na žici). Ovi geni tvore grupe veza. Broj vezanih grupa jednak je broju hromozoma u haploidnom skupu. Zbirka alela na jednom hromozomu naziva se haplotip. Primjeri haplotipova: ABCD (samo dominantni aleli), abcd (samo recesivni aleli), AbCd (razne kombinacije dominantnih i recesivnih alela).
3. Ako su geni povezani jedni s drugima, tada postoji učinak povezanog nasljeđivanja osobina, tj. nekoliko osobina se nasljeđuje kao da ih kontrolira jedan gen. Uz povezano nasljeđivanje, izvorne kombinacije svojstava čuvaju se u nizu generacija.
4. Veza gena nije apsolutna: u većini slučajeva homologni hromozomi razmjenjuju alele kao rezultat ukrštanja (ukrštanja) u profazi prve mejotičke diobe. Kao rezultat ukrštanja nastaju ukršteni hromozomi (pojavljuju se novi haplotipovi, tj. Nove kombinacije alela.). Uz učešće ukrštenih hromozoma u narednim generacijama, nove kombinacije svojstava trebale bi se pojaviti u ukrštenih jedinki.
5. Vjerovatnoća novih kombinacija svojstava uslijed ukrštanja izravno je proporcionalna fizičkoj udaljenosti između gena. To vam omogućava da odredite relativnu udaljenost između gena i izgradite genetske (unakrsne) mape različitih vrsta organizama.
CROSSINGOVER
Crossover (od engleskog cross-over - prelazak) je proces razmjene homolognih regija homolognih hromozoma (hromatida).
Prelazak se obično javlja u mejozi I.
Prilikom ukrštanja dolazi do razmjene genetskog materijala (alela) između hromozoma, a zatim dolazi do rekombinacije - pojave novih kombinacija alela, na primjer AB + ab → Ab + aB.
Mehanizam prelaska preko ponovnog okupljanja
Prema teoriji Janssens - Darlington, prelazak se događa u fazi mejoze. Homologni hromozomi sa AB i ab hromatidama tvore bivalente. U jednoj od hromatida u prvom hromozomu dolazi do puknuća u A - B regiji, zatim u susjednoj kromatidi drugog hromozoma dolazi do puknuća u a - b regiji. Ćelija nastoji popraviti štetu pomoću enzima za popravak-rekombinaciju i pričvrstiti fragmente kromatida. Međutim, u ovom slučaju moguće je pričvršćivanje ukršteno (križanje) i nastaju rekombinantne hromatide Ab i aB. U anafazi prve podjele mejoze dolazi do divergencije dvo-kromatidnih hromozoma, a u drugoj podjeli divergencije kromatida (jedno-kromatidni hromozomi). Kromatide koje nisu sudjelovale u prelasku zadržavaju izvorne kombinacije alela. Takve se hromatide (hromozomi sa jednom hromatidom) nazivaju ne-ukrštanjem; uz njihovo sudjelovanje razvit će se gamete, zigote i pojedinci koji nisu ukršteni. Rekombinantne hromatide koje nastaju tijekom ukrštanja nose nove kombinacije alela. Takve se hromatide (jednohromatski kromosomi) nazivaju ukrštanjem; uz njihovo učešće razvit će se ukrštene gamete, zigote i jedinke. Dakle, kao rezultat križanja dolazi do rekombinacije - pojave novih kombinacija naslednih sklonosti u hromozomima.
Prema drugim teorijama, križanje je povezano s replikacijom DNK: ili u pahitenu mejoze, ili u interfazi. Konkretno, moguće je promijeniti matricu u vilici replikacije.
Genetske (crossover) mape
Alfred Sturtevant (Morganov saradnik) sugerira da učestalost ukrštanja između gena koji se nalaze na istom hromozomu može poslužiti kao mjera udaljenosti između gena. Drugim riječima, frekvencija ukrštanja, izražena kao odnos broja ukrštenih jedinki i ukupnog broja jedinki, direktno je proporcionalna udaljenost između gena. Tada se frekvencija ukrštanja može koristiti za određivanje relativnog položaja gena i udaljenosti između gena. Jedinica udaljenosti između gena je 1% prelaska; u čast Morgana, ova jedinica se naziva morganida (M).
Na osnovu genetskog mapiranja, genetske mape - dijagrami koji odražavaju položaj gena u hromozomima u odnosu na druge gene. Na genetskim mapama ekstremni gen (tj. Onaj koji je najudaljeniji od centromere) odgovara nultoj (početnoj) točki. Udaljenost gena od nulte tačke naznačena je kod morganida.
Izgradnja genetskih karata različitih organizama od velike je važnosti u zdravstvu, uzgoju i ekologiji. Proučavajući ljudske osobine (a posebno genetske bolesti), važno je znati koji gen određuje dotičnu osobinu. Ovo znanje omogućava predviđanje u medicinskom i genetskom savjetovanju, u razvoju metoda za liječenje genetskih bolesti, uklj. i za korekciju genoma. Poznavanje genetskih karata gajenih biljaka i domaćih životinja omogućava planiranje procesa uzgoja, što doprinosi postizanju pouzdanih rezultata u kratkom vremenu. Izgradnja genetskih karata divljih biljaka i divljih životinja takođe je važna sa stanovišta ekologije. Istraživač posebno dobiva priliku da proučava ne samo fenotipska svojstva organizama, već specifična, genetski određena svojstva.
Dvostruki i višestruki prelazak
Morgan je sugerirao da se ukrštanje između dva gena može dogoditi ne samo na jednoj, već i na dvije ili čak više tačaka. Parni broj ukrštanja između dva gena, u konačnici, ne dovodi do njihovog prenosa s jednog homolognog hromozoma na drugi, stoga se smanjuje broj ukrštanja i, prema tome, udaljenost između ovih gena, utvrđena u eksperimentu. To se obično odnosi na gene koji se nalaze prilično daleko jedan od drugog. Prirodno, vjerovatnoća dvostrukog ukrštanja uvijek je manja od vjerovatnoće pojedinačnog ukrštanja. U principu, to će biti jednako umnošku vjerovatnoće dva pojedinačna čina rekombinacije. Na primjer, ako će se jedan križ dogoditi s frekvencijom 0,2, onda dvostruki križ - s frekvencijom 0,2 × 0,2 \u003d 0,04. Kasnije, zajedno s dvostrukim ukrštanjem, otkriven je i fenomen višestrukog ukrštanja: homologne hromatide mogu razmjenjivati \u200b\u200bregije na tri, četiri ili više tačaka.
Smetnje - ovo je suzbijanje prelaska u oblastima neposredno uz mjesto razmjene koja se dogodila.
Razmotrite primjer opisan u jednom od Morganovih ranih djela. Istražio je učestalost križanja gena w (bijelo - bijele oči), y (žuto - žuto tijelo) i m (minijaturno - mala krila), lokalizovanih na X hromozomu D. melanogaster. Udaljenost između gena w i y kao procenat ukrštanja iznosila je 1,3, a između gena y i m - 32,6. Ako se slučajno uoče dva događaja ukrštanja, tada bi očekivani dvostruki prelazak preko frekvencije trebao biti jednak umnošku ukrštanja frekvencija između gena y i w i gena w i m. Drugim riječima, stopa dvostrukog ukrštanja iznosiće 0,43%. Zapravo, u eksperimentu je pronađen samo jedan dvostruki prelazak na 2205 muha, tj. 0,045%. Morganov student G. Möller predložio je da se intenzitet smetnji kvantitativno odredi dijeljenjem stvarno uočenog dvostrukog prelaska preko frekvencije sa teorijski očekivanom (u odsustvu smetnji) frekvencijom. Taj je pokazatelj nazvao koeficijentom slučajnosti, odnosno slučajnošću. Möller je pokazao da su smetnje u X hromozomu Drosophile posebno velike na kratkim udaljenostima; s povećanjem intervala između gena, njegov intenzitet se smanjuje, a na udaljenosti od oko 40 morganida i više, koeficijent koincidencije dostiže 1 (njegova maksimalna vrijednost).
Citološki dokazi o prelasku
Izravni citološki dokazi o razmjeni dijelova hromozoma tokom ukrštanja dobiveni su početkom 1930-ih u Drosophila i kukuruza.
Razmotrite Sternov eksperiment na D. melanogaster. Obično se dva homološka hromozoma morfološki ne razlikuju. Stern je istraživao X hromozome koji su imali morfološke razlike i, prema tome, nisu bili potpuno homologni. Međutim, homologija između ovih hromozoma zadržana je većim dijelom njihove dužine, što im je omogućilo da se normalno pare i razdvajaju u mejozi (to jest, da se normalno distribuiraju među kćerkama). Jedan od X-hromozoma ženke kao rezultat translokacije, odnosno kretanja fragmenta Y-hromozoma, dobio je oblik u obliku slova L. Drugi X hromozom bio je kraći od normalnog, jer je njegov dio prebačen u hromozom IV. Dobijene su ženke koje su bile heterozigotne za navedena dva, morfološki različita, X hromozoma, kao i heterozigotne za dva gena lokalizovana na X hromozomu: Bar (B) i karanfil (cr). Gene Bar Je poludominantni gen koji utječe na broj aspekata i, prema tome, na oblik oka (mutanti s alelom B imaju prugaste oči). Gen cr kontrolira obojenost očiju (alel cr + određuje normalnu obojenost oka, a alel cr određuje boju crvenih očiju karanfila). X-hromozom u obliku slova L nosio je alele divljeg tipa B + i cr +, a krnji hromozom imao je alele B i cr mutanta. Ženke naznačenog genotipa ukrštene su s muškarcima s morfološki normalnim X hromozomom sa alelima cr i B +. U potomstvu ženki postojale su dvije klase muha s neprekriženim hromozomima (crB / crB + i cr + B + / crB +) i dvije klase muha čiji fenotip odgovara križanjima (crB + / crB + i cr + B / crB +). Citološka studija pokazala je da su ukrštene osobe razmjenjivale dijelove X hromozoma i, shodno tome, mijenjao se njihov oblik. Sve četiri klase ženki imale su jedan normalan, odnosno štapičasti hromozom, primljen od oca. Ukrštene ženke sadržane u njihovim kariotipskim X hromozomima transformirane su kao rezultat križanja - duge šipkaste ili dvokrake kratkih ramena. Ovi eksperimenti, kao i istovremeno dobiveni slični rezultati na kukuruzu, potvrdili su hipotezu Morgana i njegovih saradnika da je prelazak razmjena regija homoloških hromozoma i da su geni zaista smješteni na hromozomima.
Somatski (mitotski) prelazak.
U somatskim ćelijama se ponekad dogodi razmjena između hromatida homolognih hromozoma, uslijed čega se uočava kombinacijska varijabilnost, slična onoj koju redovito generira mejoza. Često, posebno kod drozofile i nižih eukariota, homologni hromozomi se sintetišu u mitozi. Jedna od autosomno recesivnih mutacija kod ljudi, u homozigotnom stanju, koja dovodi do ozbiljne bolesti poznate kao Blumov sindrom, popraćena je citološkom slikom koja nalikuje sinapsi homologa, pa čak i stvaranju hijazmati.
Dokazi za mitotski prelazak je dobiven na Drosophili pri analizi varijabilnosti svojstava određenih genima y (žuto - žuto tijelo) i sn (izdvojene - izdvojene čekinje), koji se nalaze na X hromozomu. Ženka s genotipom y sn + / y + sn je heterozigotna za gene y i sn, pa će, u odsustvu mitotskog ukrštanja, njen fenotip biti normalan. Međutim, ako se križanje dogodilo u fazi četiri kromatide između kromatida različitih homologa (ali ne i između sestrinskih kromatida), a mjesto razmjene je između sn gena i centromere, tada nastaju ćelije s y sn + / y + sn + i y + sn / y + sn genotipovima. U ovom slučaju, sivo tijelo muhe s normalnim čekinjama imaće dvostruke mozaične mrlje, od kojih će jedno biti žuto s normalnim čekinjama, a drugo sivo s užarenim čekinjama. Za to je neophodno da se nakon ukrštanja oba hromozoma (nekadašnje hromatide svakog od homologa) y + sn presele na jedan pol ćelije, a hromozomi y sn + na drugi. Potomci ćerki ćelija, množeći se u fazi kukuljice, i dovest će do pojave mozaičnih mrlja. Dakle, mozaične mrlje nastaju kada se dvije grupe (tačnije, dva klona) ćelija nalaze jedna pored druge, fenotipski se međusobno razlikujući i od ćelija drugih tkiva date jedinke.
Nejednak prelazak
Ovaj fenomen detaljno je proučavan na primjeru Bar gena (očiju u prugama B) lokaliziranog na X hromozomu D. melanogaster. Nejednak prelazak povezan je s dupliciranjem mjesta u jednom od homologa i s njegovim gubitkom u drugom homologu. Utvrđeno je da gen B može biti prisutan u obliku tandema, odnosno slijedeći jedan za drugim ponavljanja koja se sastoje od dvije ili čak tri kopije. Citološka analiza potvrdila je pretpostavku da nejednako prelazak može dovesti do tandemskih duplikacija. U regiji koja odgovara lokalizaciji gena B, zabilježen je porast broja diskova proporcionalan dozi gena na politenskim hromozomskim preparatima. Pretpostavlja se da u evoluciji nejednaki prelazak stimuliše stvaranje tandemskih duplikacija različitih sekvenci i njihovu upotrebu kao sirov genetski materijal za stvaranje novih gena i novih regulatornih sistema.
Regulacija ukrštanja
Crossover Složen je fiziološki i biokemijski proces koji je pod genetskom kontrolom ćelije i na njega utječu faktori okoline. Stoga u stvarnom eksperimentu možemo govoriti o frekvenciji ukrštanja, što znači svim uvjetima u kojima je određena. Praktično ne postoji ukrštanje između heteromorfnih X i Y hromozoma. Ako bi se to dogodilo, tada bi hromozomski mehanizam određivanja spola bio stalno uništavan. Blokiranje ukrštanja između ovih hromozoma povezano je ne samo s razlikom u njihovoj veličini (to se uvijek ne uočava), već i zbog Y-specifičnih nukleotidnih sekvenci. Preduvjet za sinapsu hromozoma (ili njihovih dijelova) je homologija nukleotidnih sekvenci.
Apsolutnu većinu viših eukariota karakterizira približno ista frekvencija ukrštanja i u homogametnom i u heterogametnom spolu. Međutim, postoje vrste kod kojih Crossingove nema kod jedinki heterogametnog spola, dok se kod jedinki homogametnog spola odvija normalno. Ova situacija se opaža kod heterogametnih mužjaka Drosophila i ženki svilene bube. Značajno je da je učestalost mitotskog ukrštanja kod ovih vrsta kod muškaraca i ženki praktično ista, što ukazuje na različite elemente kontrole pojedinih faza genetske rekombinacije u klicnim i somatskim ćelijama. U heterokromatskim regijama, posebno pericentromernim regijama, učestalost ukrštanja je smanjena, pa se stoga može promijeniti stvarna udaljenost između gena u tim regijama.
Pronađeni su geni koji funkcioniraju kao crossover blokatori, ali postoje i geni koji povećavaju njegovu učestalost. Ponekad mogu izazvati primjetan broj križanja kod mužjaka drozofile. Hromozomska preuređenja, posebno inverzije, mogu takođe djelovati kao blokatori za prelazak. Oni remete normalnu konjugaciju hromozoma u zigotenu.
Utvrđeno je da na učestalost ukrštanja utječe starost organizma, kao i egzogeni faktori: temperatura, zračenje, koncentracija soli, hemijski mutageni, lijekovi, hormoni. Sa većinom ovih uticaja, povećava se učestalost prelaska.
Generalno, križanje je jedan od redovitih genetskih procesa koji kontroliraju mnogi geni, kako izravno, tako i kroz fiziološko stanje mejotičkih ili mitotičkih ćelija. Učestalost različitih vrsta rekombinacija (mejotička, mitotička ukrštanja i sestrinske razmjene kromatida) može poslužiti kao mjera djelovanja mutagenih, kancerogenih, antibiotskih itd.
Biološki značaj prelaska
Zahvaljujući povezanom nasljeđivanju, uspješne kombinacije alela su relativno stabilne. Kao rezultat toga, formiraju se grupe gena, od kojih je svaki poput jednog supergena koji kontrolira nekoliko svojstava. Istodobno, tijekom ukrštanja dolazi do rekombinacija - tj. nove kombinacije alela. Dakle, ukrštanje povećava kombinacijsku varijabilnost organizama.
Evolucijsko značenje povezanog nasljeđa. Kao rezultat veze, jedan hromozom može sadržavati i povoljne alele (na primjer A) i neutralne ili relativno nepovoljne alele (na primjer N). Ako određeni haplotip (na primjer, AN) poveća sposobnost svojih nosilaca zbog prisustva povoljnih alela A, tada će se u populaciji akumulirati i povoljni aleli i neutralni ili relativno nepovoljni N povezani s njima.
Primjer. AN haplotip ima prednost u odnosu na haplotip divljeg tipa (++) zbog prisustva povoljnog alela A, a tada će se u populaciji akumulirati N alel ako je selektivno neutralan ili čak relativno nepovoljan (ali njegov negativni učinak na kondiciju kompenzira se pozitivnim učinkom alela A ).
Evolucijski značaj prelaska. Kao rezultat ukrštanja, nepovoljni aleli, u početku povezani sa povoljnim, mogu preći u drugi hromozom. Tada nastaju novi haplotipovi koji ne sadrže nepovoljne alele, a ti nepovoljni aleli se eliminiraju iz populacije.
Primjer. Pokazalo se da je haplotip Al nepovoljan u odnosu na haplotip "divljeg tipa" (++) zbog prisustva letalnog alela l. Stoga se alel A (povoljna, neutralna oaza koja malo smanjuje kondiciju) ne može manifestirati u fenotipu, jer ovaj haplotip (Al) sadrži smrtonosni alel l. Kao rezultat ukrštanja pojavljuju se rekombinantni haplotipovi A + i + l. Haplotip + l eliminira se iz populacije, a haplotip A + je fiksiran (čak i ako alel A donekle smanjuje sposobnost svojih nosilaca).
DODACI
Principi genetskog mapiranja
Alfred Sturtevant (Morganov saradnik) sugerira da učestalost ukrštanja između gena koji se nalaze na istom hromozomu može poslužiti kao mjera udaljenosti između gena. Drugim riječima, frekvencija ukrštanja, izražena kao odnos broja ukrštenih jedinki i ukupnog broja jedinki, direktno je proporcionalna udaljenost između gena. Tada se frekvencija ukrštanja može koristiti za određivanje relativnog položaja gena i udaljenosti između gena.
Genetsko mapiranje je određivanje položaja gena u odnosu na (najmanje) dva druga gena. Konstantnost procenta ukrštanja između određenih gena omogućava im lokalizaciju. Jedinica udaljenosti između gena je 1% prelaska; u čast Morgana, ova jedinica se naziva morganida (M).
U prvoj fazi mapiranja potrebno je utvrditi da li gen pripada veznoj grupi. Što je više gena poznato u određenoj vrsti, to su rezultati mapiranja tačniji. Svi su geni podijeljeni u grupe veza. Broj vezanih grupa odgovara haploidnom skupu hromozoma. Na primjer, D. melanogaster ima 4 vezne grupe, kukuruz 10, miševi 20, a ljudi 23 vezne grupe. Broj gena u veznim skupinama u pravilu ovisi o linearnim dimenzijama odgovarajućih hromozoma. Dakle, voćna muha ima jedan (IV) tačkasti (kada se analizira pod svjetlosnim mikroskopom) hromozom. U skladu s tim, broj gena u njemu je višestruko manji nego u ostalim, što ga znatno premašuje po dužini. Također treba napomenuti da u heterokromatskim regijama hromozoma geni odsutni ili gotovo odsutni, stoga proširena područja konstitutivnog heterokromatina mogu donekle promijeniti proporcionalnost broja gena i dužinu hromozoma.
Na osnovu genetskog mapiranja izrađuju se genetske karte. Na genetskim mapama ekstremni gen (tj. Onaj koji je najudaljeniji od centromere) odgovara nultoj (početnoj) točki. Udaljenost gena od nulte tačke naznačena je kod morganida.
Ako su hromozomi dovoljno dugi, tada uklanjanje gena s nulte točke može premašiti 50 M - tada nastaje kontradikcija između udaljenosti označenih na karti, koja prelaze 50%, i gore postavljene pozicije prema kojoj bi 50% ukrštenih križanja dobivenih u eksperimentu, zapravo, trebalo značiti odsustvo veze. tj. e. lokalizacija gena u različitim hromozomima. Ova kontradikcija se objašnjava činjenicom da se prilikom sastavljanja genetičkih karata sumiraju udaljenosti između dva najbliža gena, što premašuje eksperimentalno uočeni procenat ukrštanja.
Citogenetsko mapiranje
Ova metoda se temelji na upotrebi hromozomskih preuređenja. U slučaju gigantskih politenskih hromozoma, to omogućava direktnu usporedbu rezultata genetske analize udaljenosti između proučavanih lokusa i njihovog relativnog položaja s podacima o fizičkim veličinama određenih hromozomskih regija. Zračenje i djelovanje drugih mutagena u hromozomima često rezultiraju gubitkom (delecijama) ili umetanjem malih fragmenata koji su veličine uporedive s jednim ili više lokusa. Na primjer, heterozigote možete koristiti za hromozome, od kojih će jedan nositi skup uzastopnih dominantnih alela, dok će homolog njemu nositi grupu recesivnih oblika istih gena. Ako hromozom sa dominantnim genima konstantno gubi pojedinačne lokuse, tada će se u heterozigoti pojaviti recesivna svojstva. Redoslijed pojavljivanja recesivnih osobina ukazuje na redoslijed smještaja gena.
Redoslijedom gena AbC, u slučaju delecije koja hvata gen C, u mušicama s krnjim hromozomom koji je izgubio fragment jednak genu C, u fenotipu će se pojaviti aleli c, b i A.
Generalno, usporedba genetskih (ukrštanja) i citoloških karata pokazuje njihovu korespondenciju: što veći postotak ukrštanja razdvaja par gena, to je veća fizička udaljenost između njih. Međutim, na nesklad između udaljenosti utvrđenih pomoću ove dvije metode mogu utjecati dva faktora. Prvo, to su područja u kojima je prijelaz otežan ili ga uopće nema (na primjer, u heterokromatskim područjima); drugo, fizička udaljenost bit će veća od genetske ako su geni odvojeni zonom "tihe" DNK. Mostovi proračuni pokazali su da svaka ukrštena jedinica na mapi politenskih hromozoma slinovnica D. melanogaster odgovara 4,2 μm dužine politenskih hromozoma. Ova dužina je najmanje jednaka dva do tri prosječna gena.
Karakteristike konstrukcije genetskih karata kod prokariota
Za izgradnju genetskih mapa u prokarionima koristi se fenomen konjugacije - prijenos genetskog materijala iz jedne ćelije u drugu uz pomoć posebnih kružnih molekula DNA (plazmidi, posebno uz pomoć F-plazmida).
Verovatnoća prenosa određenog gena u ćeliju primaoca zavisi od njegovog uklanjanja iz F - plazmidne DNK, tačnije, iz tačke O, u kojoj započinje replikacija F - plazmidne DNK. Što je duže vrijeme konjugacije, to je veća vjerovatnoća prijenosa datog gena. To omogućava stvaranje genetske mape bakterija u nekoliko minuta konjugacije. Na primjer, kod E. coli, gen thr (operon od tri gena koji kontroliraju biosintezu treonina) nalazi se na nultoj točki (to jest, neposredno pored F-plazmidne DNK), gen lac se prenosi nakon 8 minuta, gen recE - nakon 30 minuta, gen argR - nakon 70 minuta itd.
Ovo pitanje će se detaljnije razmotriti prilikom proučavanja genetike prokariota.
Mapiranje humanog hromozoma
Mapiranje gena temelji se na grupiranju veza. Što su poznatije mutacije i što je manji broj hromozoma, to je lakše mapiranje. U tom pogledu, osoba (pored činjenice da ne može imati klasičnu hibridološku analizu) kao objekat dvostruko je nepovoljna za mapiranje: ima relativno malo poznatih gena (barem je tako bilo do kraja 70-ih), a haploidni broj hromozoma je prilično velik - 22 (bez pola). To znači da je vjerovatnoća da će dva novootkrivena gena biti povezana 1/22. Iz tih razloga, analiza rodoslovlja, koja u određenoj mjeri zamjenjuje hibridološku analizu, daje prilično ograničene informacije o prirodi veze.
Metode genetike somatskih ćelija pokazale su se izglednijima za mapiranje ljudskih gena. Suština jednog od njih je kako slijedi. Tehnike ćelijskog inženjerstva omogućavaju kombiniranje različitih vrsta ćelija. Fuzija ćelija koje pripadaju različitim biološkim vrstama naziva se somatska hibridizacija. Suština somatske hibridizacije je dobivanje sintetičkih kultura fuzijom protoplasta različitih vrsta organizama. Za fuziju ćelija koriste se razne fizičko-hemijske i biološke metode. Nakon fuzije protoplasta formiraju se višjedrnate heterokariotske stanice. Nakon toga, tokom fuzije jezgara, formiraju se sinkariotske stanice koje sadrže hromozomske setove različitih organizama u jezgrima. Kada se takve stanice podijele in vitro, nastaju hibridne ćelijske kulture. Trenutno dobijeni i kultivirani ćelijski hibridi "čovjek × miš", "čovjek × pacov" i mnogi drugi.
U hibridnim ćelijama izvedenim iz različitih sojeva različitih vrsta, jedan od roditeljskih setova hromozoma, u pravilu, replicira se brže od drugog. Stoga potonji postepeno gubi hromozome. Ti se procesi intenzivno javljaju, na primjer, u ćelijskim hibridima između miševa i ljudi - vrsta koje se razlikuju u mnogim biokemijskim markerima. Ako istodobno slijede bilo koji biokemijski biljeg, na primjer, enzim timidin kinaza, i istovremeno provode citogenetsku kontrolu, identificirajući hromozome u klonovima nastalim nakon njihovog djelomičnog gubitka, tada, na kraju, nestanak hromozoma može biti istovremeno povezan s biokemijskim svojstvom. To znači da je gen koji kodira ovu osobinu lokaliziran na ovom hromozomu. Dakle, gen timidin kinaze kod ljudi nalazi se na hromozomu 17.
Neke informacije o lokalizaciji gena mogu se dobiti analizom numeričkih i strukturnih mutacija hromozoma, pojavom u porodicama hromozoma sa morfološkim varijacijama i uzimanjem u obzir naslednih osobina. Djelomične monosomije nastale brisanjem također se koriste u istu svrhu. Međutim, u tim slučajevima treba imati na umu da gen koji se proučava ponekad ostaje u centričnom fragmentu, ali njegova manifestacija može biti drastično oslabljena kao rezultat efekta položaja ili nekih drugih regulatornih mehanizama (promjena redoslijeda replikacije, odvajanje promotorske regije itd.) ... Krajem 60-ih razvijena je metoda hibridizacije in situ koja se temelji na specifičnosti komplementarnih interakcija između gena i njegove kopije (mRNA, kao i komplementarna DNA dobijena reverznom transkripcijom). Rezolucija ove metode je mnogo veća na politenskim hromozomima nego na ljudskim mitotičkim hromozomima, ali se neprestano poboljšava.
Mapiranje gena mapiranje gena, mapiranje - mapiranje gena.
Određivanje položaja datog gena na hromozomu u odnosu na druge gene; koristiti tri glavne grupe metoda Kg. - fizički (određivanje pomoću restrikcijskih karata, elektronska mikroskopija i neke varijante elektroforeze međugenih udaljenosti - u nukleotidima), genetski (određivanje učestalosti rekombinacija između gena, posebno u porodičnoj analizi itd.) i citogenetski (hibridizacija in situ<in situ hibridizacija\u003e, dobijanje hibridnih monosomskih ćelija<hibrid monokromosomskih ćelija\u003e, metoda brisanja<mapiranje brisanja\u003e itd.); u humanoj genetici su prihvaćena 4 stepena pouzdanosti lokalizacije ovog gena - potvrđena (uspostavljena u dvije ili više neovisnih laboratorija ili na materijalu dva ili više nezavisnih testnih objekata), preliminarna (1 laboratorij ili 1 analizirana porodica), kontradiktorna (nesklad između podataka različitih istraživača), sumnjiv (nisu konačni podaci iz jedne laboratorije); Dodatak 5 daje sažetak (od 1992. do 1993.) strukturnih gena, onkogena i pseudogena u ljudskim genomima i - uključujući neke mutacije - kod miševa.
(Izvor: „Englesko-ruski objašnjavajući rečnik genetičkih termina.“ Arefiev VA, Lisovenko LA, Moskva: Izdavačka kuća VNIRO, 1995)
Pogledajte što je "mapiranje gena" u drugim rječnicima:
mapiranje gena - Određivanje položaja datog gena na hromozomu u odnosu na druge gene; koristiti tri glavne grupe metoda K.g. fizikalno (određivanje pomoću restrikcijskih karata, elektronska mikroskopija i neke varijante elektroforeze ... ...
Mapiranje gena - određivanje položaja datog gena na hromozomu u odnosu na druge gene. Genetsko mapiranje uključuje određivanje udaljenosti prema učestalosti rekombinacija između gena. Fizičko mapiranje koristi neke tehnike ... ... Rječnik psihogenetike
mapiranje [gena] pomoću povratnog ukrštanja - Metoda genetskog mapiranja zasnovana na dobijanju backcross hibrida srodnih oblika i analizi cijepanja varijanti alela, polimorfnih u dužinama restrikcijskih fragmenata; ova metoda je najčešća u mapiranju gena u ... ... Vodič za tehničkog prevodioca
Mapiranje povratnog križanja [geni] pomoću povratnog križanja. Metoda genetskog mapiranja zasnovana na dobivanju backcross hibrida srodnih oblika i analizi cijepanja varijanti alela polimorfnih u dužini restrikcije ... ...
Mapiranje uporednih gena kod sisara - * kartovanne paranalni geni sisara * uporedno mapiranje gena sisara informativna usporedba genetskih karata ljudi i bilo koje druge vrste sisara). Moraju biti dobro proučeni i udaljeni jedni od drugih ...
Mapiranje - * kartovanne * mapiranje uspostavljanja položaja gena ili nekih određenih lokacija (vidi) duž lanca DNK (. Mapa) ... Genetika. enciklopedijski rječnik
Mapiranje ozračenim hibridima [ćelije] - * mapa dapamogeja primijenjenog hibrida [[ćelija] * zračena hibridnim mapiranjem modifikacija metode mapiranja gena korištenjem hibridizacije somatskih ćelija. Stanice hibridnog klona "glodavac H čovjek" koji sadrži samo hromozom 1 ... ... Genetika. enciklopedijski rječnik
Kartiranje radijacijskim hibridom pomoću zračenih hibrida [ćelije]. Modifikacija metode mapiranja gena korištenjem ćelija hibridizacije somatskih ćelija hibridnog klona "glodavac ˟ čovjek" koji sadrži samo 1 hromozom ... ... Molekularna biologija i genetika. Objašnjavajući rječnik.
Utvrđivanje reda gena i relativne udaljenosti između njih u veznoj grupi ... Veliki medicinski rječnik
Mapiranje ljudskog genoma
Ne trebamo uzalud uznemiravati bogove -
Postoje unutrašnjosti žrtava koje mogu pogoditi o ratu,
Robovi da šute i kamenje da grade!
Osip Mandelstam, "Priroda je isti Rim ..."
Genetika je mlada nauka. Evolucija vrsta zaista je otkrivena tek krajem 50-ih godina 19. vijeka. 1866. austrijski monah Gregor Mendel objavio je rezultate svojih eksperimenata na oprašivanju graška. Do kraja vijeka niko nije obraćao pažnju na njegovo otkriće. A Galton, na primjer, nikada nije saznao za njih. Čak je i mehanizam oplodnje - fuzija jezgara muških i ženskih klica - otkriven tek 1875. godine. 1888. godine u jezgrima ćelija pronađena su mala tijela koja se nazivaju hromozomi, a 1909. mendelski faktori nasljeđivanja imenovani su genima. Prvo veštačko osemenjavanje (na zecu, a zatim na majmunima) izvršeno je 1934. godine; i konačno, 1953. godine došlo je do temeljnog otkrića - uspostavljena je dvostruka spiralna struktura DNK. Kao što vidite, sve se to dogodilo sasvim nedavno, tako da su rani eugeničari, općenito, bili vrlo malo svjesni tehnike svog zanata.
Mapiranje ljudskog genoma još je u ranoj fazi. Ono što znamo je mali djelić onoga što ne znamo. Postoji tri milijarde sekvenci nukleotida, formirajući između dvadeset šest i trideset i osam hiljada gena, koji direktno kodiraju proteine. Ali kako geni i proteini koje oni proizvode međusobno djeluju još uvijek je slabo razumljivo.
Međutim, uloga gena u ljudskom društvu se brzo prepozna. 1998. Diana Paul (Univerzitet u Massachusettsu) prisjetila se onoga što je prije četrnaest godina nazivala
„Biološki deterministički“ pogled prema kojem geni utječu na razlike u inteligenciji i temperamentu - koristeći ove izraze kao da je određeno njihovo značenje. Danas bi njihova upotreba bila kontroverzna, jer čini se da ove oznake dovode u pitanje ovo gledište, dok je široko prihvaćeno i od strane naučnika i od javnosti ".
Bilo kako bilo, naše znanje se nadopunjava doslovno svakodnevno, a u vrlo bliskoj budućnosti moći ćemo analizirati s velikom preciznošću genetsko opterećenje,koje namećemo budućim generacijama.
Iz knjige Najnovija knjiga činjenica. Svezak 1 [Astronomija i astrofizika. Geografija i druge nauke o zemlji. Biologija i medicina] autor Iz knjige Ljudski genom: Enciklopedija napisana u četiri slova autor Iz knjige Ljudski genom [Enciklopedija napisana u četiri slova] autor Tarantul Vjačeslav Zalmanovič Iz knjige Najnovija knjiga činjenica. Svezak 1. Astronomija i astrofizika. Geografija i druge nauke o zemlji. Biologija i medicina autor Kondrashov Anatolij Pavlovič Iz knjige Dešifrirani život [Moj genom, moj život] - Venter Craig Iz knjige Biološka hemija autor Lelevich Vladimir Valerianovich Iz autorove knjige Iz autorove knjigeDIO I. STRUKTURA LJUDSKOG GENOMA ŠTO JE GENOM? Pitanja su vječna, odgovori ovise o vremenu. E. Chargaff U dijalogu sa životom nije važno njezino pitanje, već naš odgovor. MI Tsvetaeva Od samog početka ćemo definisati šta ovde podrazumevamo pod rečju „gen“. Sam pojam
Iz autorove knjigeAnaliza ukupne DNK - nove informacije o strukturi ljudskog genoma U prvoj fazi neposrednog proučavanja građe ljudskog genoma, kada metodologija genetskog inženjerstva još nije postojala, za proučavanje DNK korištene su tradicionalne fizičko-hemijske metode. IN
Iz autorove knjige Iz autorove knjigeDIO II. FUNKCIJA LJUDSKOG GENOMA KRALJICA JE UMRLA - POZDRAV KRALJICI! Ono što znamo je ograničeno, a ono što ne znamo je beskonačno. P. Laplace Nauka je uvijek u krivu. Ona nikada neće riješiti problem bez podizanja desetak novih. B. Shaw So,
Iz autorove knjigeKako je računar koristan za proučavanje ljudskog genoma? Bez kompjuterskih tehnologija bioinformatike (genoinformatika ili, u širem smislu, bioinformatika), razvoj genomskih istraživanja teško da bi uopće bio moguć. Teško je i zamisliti kako
Iz autorove knjigeDIO III. PORIJEKLO I EVOLUCIJA GENOMA LJUDI
Iz autorove knjigeKoliko se ljudski genom razlikuje od genoma čimpanze? Genom je kolekcija gena sadržanih u haploidnom (pojedinačnom) skupu hromozoma datog organizma. Genom nije karakteristika pojedinca, već vrste organizama. U februaru 2001. u Americi
Iz autorove knjigePoglavlje 11 Dešifriranje ljudskog genoma Šta ćete reći kad, penjući se s posljednjim snagama na vrh planine koju niko nikada nije posjetio, iznenada vidite osobu kako se penje paralelnom stazom? U nauci je saradnja uvek mnogo plodonosnija,
