Mappatura genetica. Strategia di mappatura genetica e suo ruolo nell'identificazione di nuovi geni di malattie ereditarie Esempi di mappatura genetica di geni di malattie umane

Alfred Sturtevant (collaboratore di Morgan) ha suggerito che la frequenza di incrocio tra geni situati sullo stesso cromosoma può servire come misura della distanza tra i geni. In altre parole, la frequenza di crossover, espressa come rapporto tra il numero di individui crossover e il numero totale di individui, è direttamente proporzionale alla distanza tra i geni. La frequenza di crossover può quindi essere utilizzata per determinare la posizione relativa dei geni e la distanza tra i geni.

La mappatura genetica è la determinazione della posizione di un gene in relazione ad (almeno) altri due geni. La costanza della percentuale di incrocio tra determinati geni ne consente la localizzazione. L'unità di distanza tra i geni è l'1% dell'incrocio; in onore di Morgan, questa unità è chiamata morganida (M) o santimorganide (CM).

Il numero di gruppi di collegamento corrisponde al set aploide di cromosomi. Ad esempio, in D. melanogaster 4 gruppi di frizione, mais 10, topi 20, esseri umani 23 gruppi di frizione. Se ci sono cromosomi sessuali, vengono indicati in aggiunta (ad esempio, una persona ha 23 gruppi di collegamento più un cromosoma Y).

Di regola, il numero di geni nei gruppi di collegamento dipende dalle dimensioni lineari dei cromosomi corrispondenti. Quindi, un moscerino della frutta ha un cromosoma punto (IV) (se analizzato al microscopio ottico). Di conseguenza, il numero di geni in esso contenuti è molte volte inferiore rispetto agli altri, superandolo in modo significativo in lunghezza. Va anche notato che nelle regioni eterocromatiche dei cromosomi non ci sono geni o quasi nessuno, quindi, regioni estese di eterocromatina costitutiva possono in qualche modo cambiare la proporzionalità del numero di geni e la lunghezza del cromosoma.

Le mappe genetiche sono compilate sulla base della mappatura genetica. Sulle mappe genetiche, il gene estremo (cioè quello più lontano dal centromero) corrisponde al punto zero (iniziale). La lontananza di un gene dal punto zero è indicata nei morganidi.

Se i cromosomi sono abbastanza lunghi, la rimozione del gene dal punto zero può superare i 50 M - allora c'è una contraddizione tra le distanze segnate sulla mappa, superiori al 50%, e la posizione postulata sopra, secondo la quale il 50% dei crossover ottenuti nell'esperimento dovrebbe effettivamente significare l'assenza di collegamento. cioè e. localizzazione di geni in diversi cromosomi. Questa contraddizione è spiegata dal fatto che durante la compilazione delle mappe genetiche vengono sommate le distanze tra i due geni più vicini, il che supera la percentuale di crossing over osservata sperimentalmente.

UNIVERSITÀ NAZIONALE DEL KAZAKH DAL NOME DI AL-FARABI

Facoltà: biologia e biotecnologia

Dipartimento: biotecnologia

"SAGGIO"

Sul tema di: FRIZIONE GENETICA E MAPPATURA DEI GENI UMANI.

Completato : studenti triennali (bt in medicina)

Nuralibekov S.Sh.

Davronova M.A.

Controllato : ph.D. , professore associato del dipartimentomolecolare

biologia e genetica Omirbekova N.Zh.

ALMATY 2018

Mappe di collegamento genetico ……………………………………………………… ..3

Metodi moderni per costruire mappe di collegamento genetico …… .......... …… ...… .5

PCR negli studi sul genoma umano ……………………………… .... …………. …… 8

Mappe fisiche a bassa risoluzione ………………………………………… ..….… .9

Mappe fisiche ad alta risoluzione …………… .. ……………………… .. ……… 11

Elenco delle fonti utilizzate ……………… ... …………… .. ………………… .13

Mappatura e determinazione della struttura primaria del genoma umano

Dopo una breve rassegna dei principali metodi più spesso utilizzati in genetica molecolare per studiare la struttura ei meccanismi del funzionamento genico, sembra opportuno esaminare più da vicino l'applicazione pratica di questi metodi e le loro modifiche per studiare i grandi genomi utilizzando l'esempio del genoma umano. Al fine di studiare in modo completo il genoma umano, questo colossale archivio delle sue informazioni genetiche, è stato recentemente sviluppato e implementato uno speciale programma internazionale "Human Genome Project". Il compito principale del programma è la costruzione di mappe genetiche complete ad alta risoluzione per ciascuno dei 24 cromosomi umani, che, in ultima analisi, dovrebbero terminare con la determinazione della struttura primaria completa del DNA di questi cromosomi. Attualmente, il lavoro sul progetto è in pieno svolgimento. In caso di esito positivo (e ciò dovrebbe accadere nel 2003, secondo i piani), l'umanità avrà prospettive per uno studio approfondito del significato funzionale e dei meccanismi di funzionamento di ciascuno dei suoi geni, nonché dei meccanismi genetici che governano la biologia umana e stabilire le cause della maggior parte delle condizioni patologiche del suo corpo ...

Approcci di base alla mappatura del genoma umano

La soluzione al compito principale del programma Genoma Umano comprende tre fasi principali. Nella prima fase, è necessario separare ogni singolo cromosoma in modo specifico in parti più piccole, consentendo la loro ulteriore analisi con metodi noti. La seconda fase della ricerca prevede la determinazione della posizione relativa di questi singoli frammenti di DNA l'uno rispetto all'altro e la loro localizzazione nei cromosomi stessi. Nella fase finale, è necessario determinare l'effettiva determinazione della struttura primaria del DNA per ciascuno dei frammenti cromosomici caratterizzati e comporre una sequenza continua completa dei loro nucleotidi. La soluzione al problema non sarà completa se nelle sequenze nucleotidiche trovate non sarà possibile localizzare tutti i geni dell'organismo e determinarne il significato funzionale. Il passaggio delle tre fasi precedenti è necessario non solo per ottenere caratteristiche complete del genoma umano, ma anche di qualsiasi altro genoma di grandi dimensioni.

Mappe di collegamento genetico

Le mappe di linkage genetico sono modelli unidimensionali della disposizione reciproca dei marcatori genetici sui singoli cromosomi. I marcatori genetici sono intesi come qualsiasi tratto fenotipico ereditato che differisce nei singoli individui. I tratti fenotipici che soddisfano i requisiti dei marcatori genetici sono molto diversi. Includono sia caratteristiche comportamentali o predisposizione a determinate malattie, sia segni morfologici di interi organismi o delle loro macromolecole, di diversa struttura. Con lo sviluppo di metodi semplici ed efficaci per lo studio delle macromolecole biologiche, tali tratti, noti come marcatori molecolari, sono diventati i più utilizzati nella costruzione di mappe di linkage genetico. Prima di procedere alla considerazione dei metodi per costruire tali mappe e delle loro implicazioni per lo studio del genoma, è necessario ricordare che il termine "linkage" è usato in genetica per denotare la probabilità di trasmissione congiunta di due tratti da un genitore alla prole.

Durante la formazione di cellule germinali (gameti) negli animali e nelle piante allo stadio della meiosi, di regola si verifica la sinapsi (coniugazione) di cromosomi omologhi. I cromatidi fratelli dei cromosomi omologhi sono collegati tra loro per tutta la loro lunghezza e, come risultato dell'incrocio (ricombinazione genetica tra cromatidi), le loro parti vengono scambiate. Più i due marcatori genetici si trovano l'uno dall'altro sul cromatide, più è probabile che si verifichi la rottura del cromatide necessaria per il crossing over tra di loro, ei due marcatori nel nuovo cromosoma appartenente al nuovo gamete saranno separati l'uno dall'altro, cioè la loro coesione sarà spezzata. L'unità di collegamento dei marcatori genetici è la morganida (unità di Morgan, M), che contiene 100 centimetri (cM). 1 cM corrisponde alla distanza fisica sulla mappa genetica tra due marker, la cui ricombinazione avviene con una frequenza dell'1%. Espresso in coppie di basi, 1 cM corrisponde a 1 milione di bp. (m.p.) DNA.

Le mappe di linkage genetico riflettono correttamente l'ordine di disposizione dei marcatori genetici sui cromosomi; tuttavia, i valori ottenuti delle distanze tra loro non corrispondono alle distanze fisiche reali. Di solito, questo fatto è associato al fatto che l'efficienza della ricombinazione tra i cromatidi nelle singole regioni dei cromosomi può variare notevolmente. In particolare, è soppresso nelle regioni eterocromatiche dei cromosomi. D'altra parte, i punti caldi di ricombinazione sono comuni nei cromosomi. L'uso di frequenze di ricombinazione per costruire mappe genetiche fisiche senza tener conto di questi fattori porterà a distorsioni (rispettivamente sottostima o sovrastima) delle distanze reali tra i marcatori genetici. Pertanto, le mappe di collegamento genetico sono le meno accurate di tutti i tipi disponibili di mappe genetiche e possono essere considerate solo come una prima approssimazione alle mappe fisiche reali. Tuttavia, in pratica, sono loro e solo loro che consentono di localizzare marcatori genetici complessi (ad esempio associati ai sintomi di una malattia) nelle prime fasi dello studio e di studiarli ulteriormente. Va ricordato che in assenza di crossing over, tutti i geni su un singolo cromosoma passerebbero insieme dai genitori alla prole, poiché sono fisicamente legati tra loro. Pertanto, i singoli cromosomi formano gruppi di linkage di geni e uno dei primi compiti della costruzione di mappe di linkage genetici è assegnare il gene studiato o la sequenza nucleotidica a un gruppo di linkage specifico. Nel prossimo. La tabella elenca i metodi moderni che, secondo V.A. McCusick, sono stati più spesso utilizzati per costruire mappe di collegamento genetico fino alla fine del 1990.

Metodi moderni per costruire mappe di linkage genetico

Metodo	Numero di loci mappati
Ibridazione delle cellule somatiche	1148
Ibridazione in situ	687
Famiglia	466
Determinazione dell'effetto della dose	159
Mappatura delle restrizioni	176
Uso di aberrazioni cromosomiche	123
Utilizzando la sintenia	110
Segregazione genica indotta da radiazioni	18
Altri metodi	143
Totale	3030

Ibridazione di cellule somatiche. Uno dei metodi più diffusi per assegnare un marker genetico (gene funzionalmente attivo) a uno specifico gruppo di collegamento è l'ibridazione (fusione tra loro) di cellule somatiche di diverse specie biologiche di organismi, una delle quali è quella studiata. Negli ibridi interspecifici di cellule somatiche, durante la coltivazione, si verifica la perdita di cromosomi, principalmente di una delle specie biologiche. La perdita di cromosomi è, di regola, casuale ei cloni di cellule risultanti contengono i cromosomi rimanenti in diverse combinazioni. L'analisi di cloni contenenti diversi set di cromosomi delle specie studiate consente di determinare a quale di questi cromosomi rimanenti è associata l'espressione del marker studiato e, di conseguenza, di localizzare il gene su uno specifico cromosoma.

Ibridazione in situ. La tecnica di ibridazione in situ è \u200b\u200banche ampiamente utilizzata per la mappatura di sequenze nucleotidiche sui cromosomi. A tale scopo, le preparazioni di cromosomi fissi vengono ibridate (incubate a temperatura elevata con successivo raffreddamento) con le sequenze nucleotidiche in esame etichettate con un'etichetta radioattiva, fluorescente o altro. Dopo aver lavato via l'etichetta non legata, le molecole di acido nucleico marcate rimanenti sono associate a regioni cromosomiche contenenti sequenze complementari alle sequenze nucleotidiche marcate studiate. Gli ibridi risultanti vengono analizzati al microscopio direttamente o dopo l'autoradiografia. Questo gruppo di metodi è caratterizzato da una risoluzione maggiore rispetto all'ibridazione delle cellule somatiche, poiché consentono di localizzare le sequenze nucleotidiche studiate sui cromosomi. Con il progredire del programma sul genoma umano, i ricercatori dispongono di sequenze nucleotidiche sempre più isolate che possono essere utilizzate come sonde per l'ibridazione in situ. A questo proposito, questi metodi in termini di frequenza di utilizzo sono recentemente risultati saldamente in testa. Il più popolare è un gruppo di metodi chiamati ibridazione in situ fluorescente (FISH), che utilizza sonde polinucleotidiche contenenti un'etichetta fluorescente. In particolare, nel 1996, sono stati pubblicati più di 600 articoli che descrivono l'uso di questo metodo.

Analisi del legame genetico familiare. Questo gruppo di metodi viene spesso utilizzato nella genetica medica per identificare il legame (collegamento) tra i sintomi di una malattia causata da una mutazione in un gene sconosciuto e altri marcatori genetici. In questo caso, i sintomi della malattia agiscono come uno dei marcatori genetici. Nel genoma umano è stato trovato un gran numero di polimorfismi, incluso RFLP. Le RFLP sono distribuite più o meno uniformemente nel genoma umano a una distanza di 5-10 cm l'una dall'altra. Più i singoli loci polimorfici si trovano vicini al gene responsabile della malattia, meno è probabile che vengano separati durante la ricombinazione nella meiosi e più spesso si verificano insieme in un individuo malato e insieme vengono trasmessi dai genitori alla prole. Dopo aver clonato una regione estesa del genoma, compreso il corrispondente marker polimorfico (la sua selezione dalla libreria di cloni del DNA genomico viene effettuata utilizzando una sonda), è possibile isolare simultaneamente un gene che con esso causa una malattia ereditaria. Tali approcci, in particolare, sono stati applicati con successo per condurre analisi familiari e isolamento dei geni corrispondenti nella distrofia muscolare di Duchenne, nella fibrosi cistica dei reni (fibrosi cistica) e nella distrofia miotonica. Il valore informativo delle singole RFLP del genoma umano dipende dal livello della loro eterozigosità nella popolazione studiata. La misura dell'informatività di RFLP come marker genetico, come suggerito da D.Botstein et al. (1980), è considerata il valore del polimorfismo information content (PIC), che è il rapporto del numero di incroci in cui almeno uno dei genitori ha il marker polimorfico studiato in uno stato eterozigote, a tutte le croci.

Determinazione dell'effetto della dose genica e uso di aberrazioni cromosomiche ... Questi metodi rivelano correlazioni tra il livello di espressione del gene studiato e il numero di cromosomi specifici in linee cellulari aneuploidi o riarrangiamenti strutturali dei cromosomi (mutazioni cromosomiche - aberrazioni). L'aneuploidia è la presenza di un numero di cromosomi in una cellula, tessuto o intero organismo che non è uguale a quello tipico di una data specie biologica. Le aberrazioni cromosomiche sotto forma di traslocazioni di regioni cromosomiche in regioni eterocromatiche dello stesso o di diversi cromosomi sono spesso accompagnate da soppressione della trascrizione di geni situati in regioni traslocate o nel cromosoma accettore (effetto mosaico di posizione).

Utilizzando la sintenia. Synthenia è la somiglianza strutturale dei gruppi di legame genico in organismi di diverse specie biologiche. In particolare, nel genoma umano e del topo sono note diverse dozzine di gruppi sintetici di geni. La presenza del fenomeno della sintenia consente di restringere la ricerca del sito di localizzazione del gene in studio sui cromosomi, limitandolo alla regione dei geni noti appartenenti ad un particolare gruppo sintetico.

Segregazione genica indotta da radiazioni ionizzanti. Utilizzando questo metodo, la distanza tra i geni in esame viene determinata valutando la probabilità della loro separazione (segregazione) dopo che le cellule sono state irradiate con una certa dose standard di radiazioni ionizzanti. Le cellule irradiate vengono salvate dalla morte mediante ibridazione con cellule somatiche di roditori e la presenza dei marcatori studiati di cellule irradiate viene determinata negli ibridi somatici in coltura. Di conseguenza, è possibile trarre conclusioni sulla presenza o l'assenza di collegamento (distanza fisica) tra questi geni.

Tra altri metodi Si dovrebbero menzionare metodi basati sull'uso di grandi frammenti di DNA generati da enzimi di restrizione a grande scissione per la mappatura dei geni. Dopo la scissione del DNA genomico, i frammenti risultanti vengono separati mediante elettroforesi in un campo elettrico pulsato e poi vengono ibridati secondo Southern con sonde corrispondenti ai geni mappati. Se, dopo l'ibridazione, i segnali di entrambe le sonde sono localizzati sullo stesso grande frammento di DNA, ciò indica uno stretto legame di tali geni.

PCR negli studi sul genoma umano

La reazione a catena della polimerasi è fondamentale per lo sviluppo di approcci all'implementazione pratica del programma sul genoma umano. Come discusso in precedenza, utilizzando la PCR, è possibile amplificare in modo rapido ed efficiente quasi tutte le regioni corte del genoma umano ei prodotti PCR risultanti possono quindi essere utilizzati come sonde per mappare le regioni corrispondenti sui cromosomi mediante ibridazione meridionale o in situ.

Concetto STS. Uno dei concetti chiave alla base della mappatura dei geni umani nel quadro del programma discusso è il concetto di siti con tag di sequenza (STS). In accordo con questo concetto, tutti i frammenti di DNA utilizzati per costruire mappe genetiche o fisiche possono essere identificati in modo univoco utilizzando una sequenza nucleotidica di 200-500 bp che sarà unica per un dato frammento. Ciascuno di questi siti deve essere sequenziato, il che consentirà di amplificarli ulteriormente utilizzando la PCR e utilizzarli come sonde. L'uso di STS consentirebbe di utilizzare le loro sequenze sotto forma di prodotti PCR come sonde per l'isolamento mirato di qualsiasi frammento di DNA di una particolare regione del genoma da una raccolta di sequenze genomiche. Di conseguenza, è possibile creare database che includono la localizzazione e la struttura di tutti gli STS, nonché i primer necessari per la loro amplificazione. Ciò eliminerebbe la necessità per i laboratori di immagazzinare numerosi cloni e inviarli ad altri laboratori per la ricerca. Inoltre, gli STS forniscono la base per lo sviluppo di un unico linguaggio in cui diversi laboratori potrebbero descrivere i loro cloni. Pertanto, il risultato finale dello sviluppo del concetto di STS sarebbe una mappa completa del STS del genoma umano. Teoricamente, per costruire una mappa genetica di 1 cm di dimensione, sono necessari 3000 marcatori di DNA polimorfici completamente informativi. Tuttavia, poiché i marcatori polimorfici sono distribuiti in modo non uniforme nel genoma e solo pochi di essi sono completamente informativi, il numero effettivo di marcatori necessari per costruire una mappa di queste dimensioni è stimato a 30-50 mila. Per ottenere marcatori corrispondenti alle regioni dei cromosomi in studio vengono spesso utilizzati primer corrispondenti a sequenze ripetitive disperse, tra cui le prime ad essere utilizzate le sequenze Alu.

Alu-PCR.Le sequenze Alu ripetute disperse sono caratteristiche del genoma umano. I primer specifici per le sequenze Alu vengono utilizzati per amplificare le regioni del DNA del genoma umano racchiuse tra le ripetizioni Alu, che si trovano in media a una distanza di 4-10 kb. a parte. Un'altra opzione per Alu-PCR è la sintesi diretta di sonde di DNA con il suo aiuto a regioni di cromosomi ottenuti dopo la frammentazione laser, singoli cromosomi isolati mediante citometria a flusso o DNA di cellule ibride contenenti una certa parte del genoma umano. Inoltre, Alu-PCR viene utilizzato per ottenere impronte digitali uniche che caratterizzano gli ibridi cellulari in termini di stabilità del genoma, nonché per caratterizzare frammenti di DNA umano clonati in vettori YAC, cosmidi o vettori basati sul DNA del batteriofago. L'unicità delle sequenze Alu per il genoma umano rende possibile utilizzarle per “camminare lungo i cromosomi”, nonché per espandere i contigui esistenti. Poiché\u003e 90% delle sequenze moderatamente ripetitive nel genoma umano sono rappresentate dalle famiglie Alu e KpnI, non sorprende che queste ultime siano utilizzate anche in PCR per gli stessi scopi di Alu. Tuttavia, qui i profili dei prodotti della PCR sono meno complessi, poiché le sequenze KpnI si ripetono meno frequentemente nel genoma e hanno una localizzazione caratteristica nei cromosomi.

La PCR viene utilizzata attivamente per identificare i marcatori molecolari polimorfici durante la costruzione di mappe di collegamento genetico, i cui principi di base sono stati discussi sopra. Questo metodo è utile anche nel sequenziamento del DNA, nonché nella costruzione di mappe fisiche ad alta risoluzione per il genoma umano. Le ultime due aree di applicazione della PCR saranno discusse in maggior dettaglio di seguito.

Mappe fisiche a bassa risoluzione

In contrasto con le mappe di collegamento genetico discusse sopra, le mappe fisiche del genoma riflettono la distanza reale tra i marcatori, espressa in coppie di basi. Le mappe fisiche differiscono nel loro grado di risoluzione, ad es. sui dettagli della struttura del genoma che vengono presentati su di essi. Una mappa fisica completa del genoma umano di massima risoluzione conterrà la sequenza nucleotidica completa di tutti i suoi cromosomi. All'estremo opposto delle mappe fisiche con risoluzione minima ci sono le mappe cromosomiche (citogenetiche) del genoma.

Quattro tipi di mappe genetiche del DNA genomico e loro relazione

1 - mappa di collegamento genetico, 2 - mappa di restrizione fisica, gli spazi indicano i siti di scissione del DNA da parte degli enzimi di restrizione, 3 - mappa fisica di contig, che mostra cloni di DNA sovrapposti ottenuti usando vettori YAC, 4 - mappa fisica completa sotto forma di sequenza nucleotidica del DNA. Tutte le mappe mostrano la stessa regione cromosomica

Mappe cromosomiche. Le mappe cromosomiche del genoma umano sono ottenute mediante localizzazione di marcatori genetici su singoli cromosomi utilizzando metodi citogenetici, tra cui autoradiografia e FISH. Negli ultimi due casi, le etichette radioattive o fluorescenti associate ai loci genetici studiati di cromosomi intatti vengono rilevate mediante microscopia ottica. Abbastanza recentemente, le mappe cromosomiche hanno permesso di localizzare il frammento di DNA studiato su un cromosoma 10 mp. I moderni metodi di ibridazione in situ che utilizzano cromosomi metafase, principalmente il metodo FISH, localizzano i marcatori polinucleotidici entro 2-5 bp. Inoltre, durante l'ibridazione in situ con cromosomi interfase, in cui il materiale genetico è in una forma meno compatta, la risoluzione delle mappe cromosomiche si avvicina a 100 kbp.

L'accuratezza delle mappe cromosomiche è anche migliorata con l'uso di metodi genetici moderni. Ad esempio, la capacità della PCR di amplificare segmenti di DNA di una singola cellula spermatica consente di studiare un gran numero di meiosi, per così dire, conservate in singoli campioni di sperma. Di conseguenza, diventa possibile controllare la posizione relativa dei marcatori genetici localizzati sulle mappe cromosomiche utilizzando metodi più rudimentali.

Mappe CDNA... Le mappe CDNA riflettono la posizione delle regioni del DNA espresse (esoni) rispetto ai marcatori citogenetici noti (bande) sui cromosomi in metafase. Poiché tali mappe forniscono un'idea della localizzazione delle regioni trascritte del genoma, compresi i geni con funzioni sconosciute, possono essere utilizzate per cercare nuovi geni. Questo approccio è particolarmente utile quando si ricercano geni il cui danno causa malattie umane, se la localizzazione approssimativa di tali regioni cromosomiche è già stata precedentemente effettuata su mappe di linkage genetico come risultato dell'analisi genetica familiare.

Mappe fisiche ad alta risoluzione

Due strategie per costruire mappe del DNA fisico

a - strategia "top-down": il DNA dell'intero cromosoma viene scisso da enzimi di restrizione a grande scissione, viene costruita una mappa di restrizione per ciascuno dei singoli frammenti di DNA; b - strategia bottom-up, i singoli cloni YAC vengono combinati in contig dopo l'identificazione

Nel tentativo di costruire mappe del genoma umano ad alta risoluzione, sono stati implementati sperimentalmente due approcci alternativi, chiamati mappatura top-down e mappatura bottom-up. Quando si mappano dall'alto verso il basso, l'analisi iniziale è una preparazione del DNA di un singolo cromosoma umano. Il DNA viene tagliato con enzimi di restrizione a scissione larga (ad esempio NotI) in lunghi frammenti che, dopo la separazione mediante elettroforesi in un campo elettrico pulsato, vengono sottoposti ad ulteriori analisi di restrizione con altri enzimi di restrizione. Di conseguenza, si ottiene una mappa di macrorestrizioni, su cui tutte le sequenze del cromosoma studiato o di una sua parte sono sufficientemente rappresentate, ma la sua risoluzione è bassa. È molto difficile localizzare i singoli geni su una mappa del genere. Inoltre, ogni singola mappa copre raramente segmenti di DNA estesi (di regola, non più di 1–10 mp).

Durante la mappatura del genoma umano dal basso verso l'alto, in base alla preparazione del DNA totale del genoma o del singolo cromosoma, si ottengono una serie di cloni casuali di sequenze di DNA estese (10–1000 kb), alcuni dei quali si sovrappongono tra loro. In questo caso, i mini-cromosomi artificiali di batteri (BAC) o lievito (YAC) sono spesso usati come vettore per la clonazione, descritti in dettaglio nella sezione 7.2.4. Una serie di cloni parzialmente sovrapposti e complementari formano una sequenza nucleotidica di DNA contigua chiamata contig. La correttezza dei contigui ottenuti è confermata dall'ibridazione in situ (FISH) con il loro legame simultaneo a certe regioni dei cromosomi studiati. Le mappe basate su Contig forniscono informazioni complete sulla struttura dei singoli segmenti cromosomici e consentono di localizzare i singoli geni. Tuttavia, tali mappe sono difficili da utilizzare per la ricostruzione di interi cromosomi o delle loro sezioni estese a causa dell'assenza dei cloni corrispondenti nelle librerie di geni esistenti di cloni.

Il problema principale che deve essere risolto quando si utilizzano entrambi gli approcci alla costruzione di mappe fisiche ad alta risoluzione è l'unificazione di frammenti di DNA sparsi in sequenze nucleotidiche contigue. Molto spesso, per questo vengono utilizzati frammenti di DNA clonato speciali, chiamati cloni di collegamento. I frammenti di DNA da cloni leganti contengono sequenze nucleotidiche di endonucleasi di restrizione a grande scissione nelle loro parti interne e, quindi, rappresentano le giunzioni dei frammenti di DNA utilizzati nelle prime fasi della mappatura fisica. Mediante l'ibridazione meridionale, durante la quale vengono utilizzati come sonde frammenti di DNA di cloni leganti, vengono determinati frammenti di DNA di mappe fisiche contenenti sequenze nucleotidiche in prossimità di siti di restrizione di endonucleasi di restrizione a grande scissione. Se vengono trovati due di questi frammenti, il clone di collegamento corrispondente si sovrappone a entrambi questi frammenti e fa parte di essi. I cloni di legame, a loro volta, vengono selezionati da banche genetiche utilizzando sonde, che sono sequenze nucleotidiche di siti di restrizione enzimatici di restrizione a grande scissione.

ELENCO USATO FONTI

1) Clark M.S. Genomica comparativa: la chiave per comprendere il progetto sul genoma umano // BioEssays. 1999. Vol. 21. P. 21-30.

2) Billings P.R., Smith C.L., Cantor C.L. Nuove tecniche per la mappatura fisica del genoma umano // FASEB J. 1991. Vol. 5. P. 28–34.

3) Georgiev G.P. Geni di organismi superiori e loro espressione. Mosca: Nauka, 1989.254 p.

4) http://referatwork.ru/refs/source/ref-8543.html

Poco dopo la riscoperta delle leggi di Mendel, il citologo tedesco Theodor Boveri (1902) presentò prove della partecipazione dei cromosomi ai processi di trasmissione ereditaria, dimostrando che il normale sviluppo del riccio di mare è possibile solo se tutti i cromosomi sono presenti. Allo stesso tempo (1903), il citologo americano William Setton attirava l'attenzione sul parallelismo nel comportamento dei cromosomi nella meiosi e sui fattori ipotetici di ereditarietà, la cui esistenza era già stata predetta dallo stesso Mendel.

William Setton ha suggerito che diversi geni possono essere trovati su un cromosoma. In questo caso, dovrebbe esserci un'eredità collegata dei tratti, ad es. diversi tratti differenti possono essere ereditati come se fossero controllati da un singolo gene. Nel 1906, W. Batson e R. Pennett scoprirono l'eredità collegata nei piselli dolci. Hanno studiato l'ereditarietà congiunta: i colori dei fiori (viola o rosso) e le forme dei grani di polline (allungati o rotondi). Quando si incrociano i dieterozigoti, è stata osservata una divisione di 11.1: 0.9: 0.9: 3.1 nella loro prole invece del previsto 9: 3: 3: 1. Sembrava che i fattori di colore e forma del polline tendessero a rimanere insieme durante la ricombinazione delle inclinazioni. Gli autori hanno chiamato questo fenomeno "attrazione reciproca di fattori", ma non sono riusciti a scoprirne la natura.

Ulteriori studi sui cromosomi come portatori di informazioni hanno avuto luogo nei primi decenni del XX secolo nel laboratorio di Thomas Hunt Morgan (USA) e dei suoi collaboratori (A. Sturtevant, K. Bridges, G. Möller). Morgan ha utilizzato il moscerino della frutta Drosophila melanogaster come principale oggetto di ricerca, che si è rivelato un oggetto modello molto conveniente:

- In primo luogo, questa mosca è facilmente coltivabile in condizioni di laboratorio.

- In secondo luogo, è caratterizzato da un piccolo numero di cromosomi (2 n \u003d 8).

- In terzo luogo, nelle ghiandole salivari delle larve di Drosophila ci sono cromosomi giganti (politene) che sono convenienti per l'osservazione diretta.

- E, infine, la Drosophila si distingue per l'elevata variabilità dei caratteri morfologici.

Sulla base di esperimenti con la mosca della frutta Drosophila Morgan e i suoi studenti, è stata sviluppata la teoria cromosomica dell'ereditarietà.

Le principali disposizioni della teoria cromosomica dell'ereditarietà:

1. Gene È un fattore ereditario elementare (il termine "elementare" significa "indivisibile senza perdita di qualità"). Un gene è una sezione di un cromosoma responsabile dello sviluppo di un tratto specifico. In altre parole, i geni si trovano sui cromosomi.

2. Un cromosoma può contenere migliaia di geni disposti in modo lineare (come perline su una corda). Questi geni formano gruppi di collegamento. Il numero di gruppi di collegamento è uguale al numero di cromosomi nell'insieme aploide. Una raccolta di alleli su un cromosoma è chiamata aplotipo. Esempi di aplotipi: ABCD (solo alleli dominanti), abcd (solo alleli recessivi), AbCd (varie combinazioni di alleli dominanti e recessivi).

3. Se i geni sono collegati tra loro, si verifica un effetto di ereditarietà collegata dei tratti, ad es. diversi tratti vengono ereditati come se fossero controllati da un singolo gene. Con l'eredità collegata, le combinazioni originali di tratti vengono preservate in una successione di generazioni.

4. Il legame dei geni non è assoluto: nella maggior parte dei casi, i cromosomi omologhi si scambiano alleli come risultato dell'incrocio (crossing over) nella profase della prima divisione meiotica. Come risultato dell'incrocio, si formano cromosomi incrociati (compaiono nuovi aplotipi, cioè nuove combinazioni di alleli). Con la partecipazione dei cromosomi crossover nelle generazioni successive, nuove combinazioni di tratti dovrebbero apparire negli individui crossover.

5. La probabilità di nuove combinazioni di tratti dovute al crossing over è direttamente proporzionale alla distanza fisica tra i geni. Ciò consente di determinare la distanza relativa tra i geni e costruire mappe genetiche (crossover) di diversi tipi di organismi.

ATTRAVERSANDO

Crossover (dall'inglese crossing-over - crossing) è un processo di scambio di regioni omologhe di cromosomi omologhi (cromatidi).

Il cross over si verifica solitamente nella meiosi I.

Quando si incrociano, si verifica uno scambio di materiale genetico (alleli) tra i cromosomi e quindi si verifica la ricombinazione: la comparsa di nuove combinazioni di alleli, ad esempio AB + ab → Ab + aB.

Meccanismo di break-reunite crossing-over

Secondo la teoria di Janssens-Darlington, l'incrocio avviene nella profase della meiosi. I cromosomi omologhi con cromatidi AB e ab formano bivalenti. In uno dei cromatidi nel primo cromosoma, si verifica una rottura nella regione A - B, quindi nel cromatide adiacente del secondo cromosoma, si verifica una rottura nella regione a - b. La cellula cerca di riparare il danno con l'aiuto di enzimi di riparazione-ricombinazione e di attaccare frammenti di cromatidi. Tuttavia, in questo caso è possibile unire trasversalmente (crossing over) e si formano cromatidi ricombinanti Ab e aB. Nell'anafase della prima divisione della meiosi, si verifica una divergenza dei cromosomi a due cromatidi e nella seconda divisione, una divergenza dei cromatidi (cromosomi monocromatidi). I cromatidi che non hanno partecipato al crossing over mantengono le combinazioni originali di alleli. Tali cromatidi (cromosomi monocromatidi) sono chiamati non-crossover; con la loro partecipazione si svilupperanno gameti, zigoti e individui non incrociati. I cromatidi ricombinanti che si formano durante l'incrocio portano nuove combinazioni di alleli. Tali cromatidi (cromosomi monocromatidi) sono chiamati crossover; con la loro partecipazione, si svilupperanno gameti incrociati, zigoti e individui. Pertanto, come risultato del crossing over, si verifica la ricombinazione: la comparsa di nuove combinazioni di inclinazioni ereditarie nei cromosomi.

Secondo altre teorie, il crossing over è associato alla replicazione del DNA: nel pachitene della meiosi o nell'interfase. In particolare, è possibile modificare la matrice nel fork di replica.

Mappe genetiche (crossover)

Alfred Sturtevant (collaboratore di Morgan) ha suggerito che la frequenza di incrocio tra geni situati sullo stesso cromosoma può servire come misura della distanza tra i geni. In altre parole, la frequenza di crossing over, espressa come rapporto tra il numero di individui crossover e il numero totale di individui, è direttamente proporzionale alla distanza tra i geni. La frequenza di crossover può quindi essere utilizzata per determinare la posizione relativa dei geni e la distanza tra i geni. L'unità di distanza tra i geni è l'1% dell'incrocio; in onore di Morgan, questa unità è chiamata morganida (M).

Basato sulla mappatura genetica, mappe genetiche - diagrammi che riflettono la posizione dei geni nei cromosomi rispetto ad altri geni. Sulle mappe genetiche, il gene estremo (cioè quello più lontano dal centromero) corrisponde al punto zero (iniziale). La lontananza di un gene dal punto zero è indicata nei morganidi.

La costruzione di mappe genetiche di vari organismi è di grande importanza per l'assistenza sanitaria, l'allevamento e l'ecologia. Quando si studiano i tratti umani (e in particolare le malattie genetiche), è importante sapere quale gene determina il tratto in questione. Questa conoscenza rende possibile fare previsioni nella consulenza medica e genetica, nello sviluppo di metodi per il trattamento delle malattie genetiche, incl. e per la correzione del genoma. La conoscenza delle mappe genetiche delle piante coltivate e degli animali domestici consente di programmare il processo di allevamento, che contribuisce ad ottenere risultati affidabili in breve tempo. Anche la costruzione di mappe genetiche di piante selvatiche e animali selvatici è importante dal punto di vista ecologico. In particolare, il ricercatore ha l'opportunità di studiare non solo i tratti fenotipici degli organismi, ma anche i tratti specifici geneticamente determinati.

Incrocio doppio e multiplo

Morgan ha suggerito che l'incrocio tra due geni può avvenire non solo in uno, ma anche in due o anche più punti. Un numero pari di incroci tra due geni, in definitiva, non porta al loro trasferimento da un cromosoma omologo a un altro; quindi, il numero di crossover e, quindi, la distanza tra questi geni, determinata nell'esperimento, diminuisce. Questo di solito si riferisce a geni situati piuttosto lontani l'uno dall'altro. Naturalmente, la probabilità di una doppia croce è sempre inferiore alla probabilità di una singola croce. In linea di principio, sarà uguale al prodotto della probabilità di due singoli atti di ricombinazione. Ad esempio, se si verifica una singola croce con una frequenza di 0,2, quindi una doppia croce - con una frequenza di 0,2 × 0,2 \u003d 0,04. Successivamente, insieme al double crossing over, è stato scoperto anche il fenomeno dell'incrocio multiplo: i cromatidi omologhi possono scambiare regioni in tre, quattro o più punti.

Interferenza - Si tratta della soppressione del passaggio nelle aree immediatamente adiacenti al punto dello scambio avvenuto.

Considera l'esempio descritto in uno dei primi lavori di Morgan. Ha studiato la frequenza di incrocio tra i geni w (bianco - occhi bianchi), y (corpo giallo - giallo) em (miniatura - piccole ali), localizzati sul cromosoma X di D. melanogaster. La distanza tra i geni w e y come percentuale di crossing over era 1,3 e tra i geni y e m - 32,6. Se due eventi di crossover si verificano per caso, la frequenza di double crossing over prevista dovrebbe essere uguale al prodotto delle frequenze di crossing over tra i geni y e w e i geni w e m. In altre parole, il tasso di double crossover sarà dello 0,43%. Infatti, nell'esperimento, è stato riscontrato un solo double crossing over per 2205 mosche, ovvero lo 0,045%. Lo studente di Morgan G. Möller ha proposto di determinare quantitativamente l'intensità dell'interferenza dividendo il doppio attraversamento effettivamente osservato sulla frequenza per la frequenza teoricamente prevista (in assenza di interferenza). Ha chiamato questo indicatore il coefficiente di coincidenza, cioè coincidenza. Möller ha dimostrato che l'interferenza nel cromosoma X della Drosophila è particolarmente grande a brevi distanze; con un aumento dell'intervallo tra i geni, la sua intensità diminuisce e a una distanza di circa 40 morganidi e oltre, il coefficiente di coincidenza raggiunge 1 (il suo valore massimo).

Evidenza citologica di attraversamento

La prova citologica diretta dello scambio di parti di cromosomi durante il crossing-over è stata ottenuta all'inizio degli anni '30 in Drosophila e mais.

Considera l'esperimento di Stern su D. melanogaster. Di solito, due cromosomi omologhi sono morfologicamente indistinguibili. Stern ha studiato i cromosomi X, che avevano differenze morfologiche e, quindi, non erano completamente omologhi. Tuttavia, l'omologia tra questi cromosomi è stata preservata per la maggior parte della loro lunghezza, il che ha permesso loro di accoppiarsi normalmente e di segregarsi nella meiosi (cioè di essere normalmente distribuiti tra le cellule figlie). Uno dei cromosomi X della femmina come risultato della traslocazione, cioè il movimento di un frammento del cromosoma Y, ha acquisito una forma a forma di L. Il secondo cromosoma X era più corto di quello normale, poiché una parte di esso è stata trasferita al cromosoma IV. Sono state ottenute femmine eterozigoti per i due cromosomi X indicati, morfologicamente diversi, nonché eterozigoti per due geni localizzati sul cromosoma X: Bar (B) e garofano (cr). Gene Bar È un gene semidominante che influenza il numero di sfaccettature e, quindi, la forma dell'occhio (i mutanti con l'allele B hanno gli occhi a strisce). Il gene cr controlla la colorazione degli occhi (l'allele cr + determina la normale colorazione degli occhi e l'allele cr determina il colore degli occhi del garofano rosso). Il cromosoma X a forma di L portava gli alleli B + e cr + di tipo selvatico e il cromosoma troncato portava gli alleli mutanti B e cr. Le femmine del genotipo indicato sono state incrociate con maschi con un cromosoma X morfologicamente normale con gli alleli cr e B +. La prole di femmine conteneva due classi di mosche con cromosomi non crossover (crB / crB + e cr + B + / crB +) e due classi di mosche, il cui fenotipo corrispondeva a crossover (crB + / crB + e cr + B / crB +). Lo studio citologico ha mostrato che gli individui incrociati si scambiavano sezioni dei cromosomi X e, di conseguenza, la loro forma cambiava. Tutte e quattro le classi di femmine avevano un cromosoma normale, cioè a forma di bastoncello, ricevuto dal padre. Le femmine crossover contenute nei loro cromosomi del cariotipo X si sono trasformate in seguito all'incrocio: un lungo bastoncino o due braccia con spalle corte. Questi esperimenti, così come hanno ottenuto simultaneamente risultati simili sul mais, hanno confermato l'ipotesi di Morgan e dei suoi collaboratori che il crossing over sia uno scambio di regioni di cromosomi omologhi e che i geni siano effettivamente localizzati sui cromosomi.

Incrocio somatico (mitotico).

Nelle cellule somatiche si verificano talvolta scambi tra cromatidi di cromosomi omologhi, a seguito dei quali si osserva una variabilità combinativa, simile a quella che viene regolarmente generata dalla meiosi. Spesso, specialmente nella Drosophila e negli eucarioti inferiori, i cromosomi omologhi sono sinapsi nella mitosi. Una delle mutazioni autosomiche recessive nell'uomo, in uno stato omozigote, che porta a una grave malattia nota come sindrome di Blum, è accompagnata da un quadro citologico che ricorda una sinapsi di omologhi e persino la formazione di chiasmi.

Prove di attraversamento mitotico è stato ottenuto su Drosophila analizzando la variabilità dei tratti determinati dai geni y (corpo giallo - giallo) e sn (setole bruciacchiate), che si trovano sul cromosoma X. Una femmina con genotipo y sn + / y + sn è eterozigote per i geni y e sn, e quindi, in assenza di incrocio mitotico, il suo fenotipo sarà normale. Tuttavia, se il crossing over si è verificato nella fase di quattro cromatidi tra cromatidi di omologhi diversi (ma non tra cromatidi fratelli) e il sito di scambio è tra il gene sn e il centromero, si formano cellule con i genotipi y sn + / y + sn + e y + sn / y + sn. In questo caso, sul corpo grigio di una mosca con setole normali appariranno macchie gemelle di mosaico, una delle quali sarà gialla con setole normali e l'altra grigia con setole bruciate. Per questo, è necessario che, dopo aver attraversato, entrambi i cromosomi (ex cromatidi di ciascuno degli omologhi) y + sn si spostino su un polo della cellula e i cromosomi y sn + sull'altro. Discendenti di cellule figlie, che si moltiplicano nella fase pupale e porteranno alla comparsa di macchie di mosaico. Pertanto, le macchie di mosaico si formano quando due gruppi (più precisamente, due cloni) di cellule si trovano uno accanto all'altro, fenotipicamente diversi l'uno dall'altro e dalle cellule di altri tessuti di un dato individuo.

Attraversamento diseguale

Questo fenomeno è stato studiato in dettaglio utilizzando l'esempio del gene Bar (B - stripe eyes) localizzato sul cromosoma X di D. melanogaster. Un attraversamento diseguale è associato alla duplicazione di un sito in uno degli omologhi e alla sua perdita in un altro omologo. Si è riscontrato che il gene B può essere presente sotto forma di tandem, ovvero, susseguendosi una dopo l'altra, si ripetono costituite da due o anche tre copie. L'analisi citologica ha confermato l'ipotesi che un attraversamento ineguale può portare a duplicazioni in tandem. Nella regione corrispondente alla localizzazione del gene B, è stato notato un aumento del numero di dischi proporzionale alla dose del gene sulle preparazioni cromosomiche di politene. Si presume che in evoluzione, il crossing over ineguale stimoli la creazione di duplicazioni tandem di sequenze diverse e il loro utilizzo come materiale genetico grezzo per la formazione di nuovi geni e nuovi sistemi di regolazione.

Regolazione crossover

Crossover È un processo fisiologico e biochimico complesso che è sotto il controllo genetico di una cellula ed è influenzato da fattori ambientali. Pertanto, in un esperimento reale, possiamo parlare della frequenza di crossing-over, ovvero di tutte le condizioni in cui è stata determinata. Non esiste praticamente alcun crossover tra i cromosomi X e Y eteromorfi. Se accadesse, il meccanismo cromosomico della determinazione del sesso verrebbe costantemente distrutto. Il blocco dell'incrocio tra questi cromosomi è associato non solo alla differenza delle loro dimensioni (non sempre si osserva), ma anche a causa di sequenze nucleotidiche Y-specifiche. Un prerequisito per la sinapsi dei cromosomi (o delle loro sezioni) è l'omologia delle sequenze nucleotidiche.

La maggioranza assoluta degli eucarioti superiori è caratterizzata da approssimativamente la stessa frequenza di attraversamento in entrambi i sessi omogamico ed eterogamico. Esistono però specie in cui il Crossingover è assente negli individui di sesso eterogamico, mentre negli individui di sesso omogamico procede normalmente. Questa situazione si osserva nei maschi eterogamici di Drosophila e nelle femmine di bachi da seta. È significativo che la frequenza di attraversamento mitotico in queste specie nei maschi e nelle femmine sia praticamente la stessa, il che indica diversi elementi di controllo per i singoli stadi di ricombinazione genetica nelle cellule germinali e somatiche. Nelle regioni eterocromatiche, in particolare nelle regioni pericentromeriche, la frequenza di crossing over è ridotta e quindi la distanza reale tra i geni in queste regioni può essere modificata.

È stato scoperto che i geni funzionano come bloccanti del crossover, ma ci sono anche geni che aumentano la sua frequenza. A volte possono indurre un notevole numero di crossover nella drosofila maschile. Anche i riarrangiamenti cromosomici, in particolare le inversioni, possono agire come bloccanti del crossing-over. Interrompono la normale coniugazione dei cromosomi nello zigotene.

Si è riscontrato che la frequenza degli attraversamenti è influenzata dall'età del corpo, oltre che da fattori esogeni: temperatura, radiazioni, concentrazione di sali, mutageni chimici, farmaci, ormoni. Con la maggior parte di queste influenze, la frequenza degli incroci aumenta.

In generale, il crossing over è uno dei processi genetici regolari controllati da molti geni, sia direttamente che attraverso lo stato fisiologico delle cellule meiotiche o mitotiche. La frequenza di vari tipi di ricombinazioni (meiotico, attraversamento mitotico e scambi di cromatidi fratelli) può servire come misura dell'azione di mutageni, cancerogeni, antibiotici, ecc.

Il significato biologico del crossing over

Grazie all'ereditarietà collegata, le combinazioni riuscite di alleli sono relativamente stabili. Di conseguenza, si formano gruppi di geni, ognuno dei quali è un singolo supergene che controlla diversi tratti. Allo stesso tempo, durante il crossing over, si verificano ricombinazioni, ad es. nuove combinazioni di alleli. Pertanto, il crossing over aumenta la variabilità combinatoria degli organismi.

Il significato evolutivo dell'eredità collegata. Come risultato del collegamento, un cromosoma può contenere sia alleli favorevoli (ad esempio A) che neutri o relativamente sfavorevoli (ad esempio N). Se un certo aplotipo (ad esempio AN) aumenta l'idoneità dei suoi portatori a causa della presenza di alleli favorevoli A, allora nella popolazione si accumuleranno sia alleli favorevoli che N neutro o relativamente sfavorevole ad essi collegati.

Esempio. L'aplotipo AN ha un vantaggio sull'aplotipo wild type (++) a causa della presenza di un allele A favorevole, e quindi l'allele N si accumulerà nella popolazione se è selettivamente neutro o anche relativamente sfavorevole (ma il suo effetto negativo sulla fitness è compensato dall'effetto positivo dell'allele A ).

Il significato evolutivo del crossing over. Per effetto dell'incrocio, alleli sfavorevoli, inizialmente legati a quelli favorevoli, possono passare ad un altro cromosoma. Quindi sorgono nuovi aplotipi che non contengono alleli sfavorevoli e questi alleli sfavorevoli vengono eliminati dalla popolazione.

Esempio. L'aplotipo Al risulta sfavorevole rispetto all'aplotipo "wild type" (++) a causa della presenza dell'allele letale l. Pertanto, l'allele A (favorevole, melma neutra che riduce leggermente la forma fisica) non può manifestarsi nel fenotipo, poiché questo aplotipo (Al) contiene l'allele letale l. Come risultato dell'incrocio, compaiono gli aplotipi ricombinanti A + e + l. L'aplotipo + 1 viene eliminato dalla popolazione e l'aplotipo A + viene fissato (anche se l'allele A riduce in qualche modo l'idoneità dei suoi portatori).

AGGIUNTE

Principi di mappatura genetica

Nella prima fase della mappatura, è necessario determinare l'appartenenza di un gene a un gruppo di collegamento. Più geni sono conosciuti in una data specie, più accurati saranno i risultati della mappatura. Tutti i geni sono divisi in gruppi di collegamento. Il numero di gruppi di collegamento corrisponde al set aploide di cromosomi. Ad esempio, D. melanogaster ha 4 gruppi di collegamento, il mais ne ha 10, i topi ne hanno 20 e gli esseri umani hanno 23 gruppi di collegamento. Di regola, il numero di geni nei gruppi di collegamento dipende dalle dimensioni lineari dei cromosomi corrispondenti. Quindi, un moscerino della frutta ha un cromosoma punto (IV) (se analizzato al microscopio ottico). Di conseguenza, il numero di geni in esso contenuti è molte volte inferiore rispetto al resto, superandolo in modo significativo in lunghezza. Va anche notato che nelle regioni eterocromatiche dei cromosomi non ci sono geni o quasi nessuno, quindi, regioni estese di eterocromatina costitutiva possono in qualche modo cambiare la proporzionalità del numero di geni e la lunghezza del cromosoma.

Se i cromosomi sono abbastanza lunghi, allora la rimozione del gene dal punto zero può superare i 50 M - allora sorge una contraddizione tra le distanze segnate sulla mappa, superiori al 50%, e la posizione postulata sopra, secondo la quale il 50% dei crossover ottenuti nell'esperimento, infatti, dovrebbe significare l'assenza di linkage. cioè e. localizzazione di geni in diversi cromosomi. Questa contraddizione è spiegata dal fatto che durante la compilazione delle mappe genetiche, vengono sommate le distanze tra i due geni più vicini, che supera la percentuale di crossing over osservata sperimentalmente.

Mappatura citogenetica

Questo metodo si basa sull'uso di riarrangiamenti cromosomici. Nel caso dei cromosomi politenici giganti, consente il confronto diretto dei risultati dell'analisi genetica delle distanze tra i loci studiati e della loro posizione relativa con i dati sulle dimensioni fisiche di alcune regioni cromosomiche. L'irradiazione e l'azione di altri mutageni nei cromosomi mostrano spesso delezioni (delezioni) o inserzioni di piccoli frammenti di dimensioni paragonabili a uno o più loci. Ad esempio, è possibile utilizzare eterozigoti per i cromosomi, uno dei quali porterà un gruppo di alleli dominanti successivi, mentre un omologo porterà un gruppo di forme recessive degli stessi geni. Se un cromosoma con geni dominanti perde costantemente i singoli loci, i tratti recessivi appariranno nell'eterozigote. L'ordine in cui compaiono i tratti recessivi indica la sequenza in cui si trovano i geni.

Con l'ordine dei geni AbC, nel caso di una delezione che cattura il gene C, nelle mosche con un cromosoma troncato che ha perso un frammento uguale al gene C, nel fenotipo appariranno gli alleli c, be A.

In generale, un confronto tra mappe genetiche (crossing over) e citologiche mostra la loro corrispondenza: maggiore è la percentuale di crossing over che separa una coppia di geni, maggiore è la distanza fisica tra loro. Tuttavia, la discrepanza tra le distanze determinate da questi due metodi può essere influenzata da due fattori. Innanzitutto, si tratta di aree in cui l'attraversamento è difficile o assente (ad esempio, nelle aree eterocromatiche); in secondo luogo, la distanza fisica sarà maggiore di quella genetica se i geni sono separati da una zona di DNA "silente". I calcoli di Bridges hanno mostrato che ciascuna unità di crossover sulla mappa dei cromosomi di politene delle ghiandole salivari di D. melanogaster corrisponde a 4,2 μm di lunghezza dei cromosomi di politene. Questa lunghezza è almeno uguale a due o tre geni medi.

Caratteristiche della costruzione di mappe genetiche nei procarioti

Per costruire mappe genetiche nei procarioti, viene utilizzato il fenomeno della coniugazione: il trasferimento di materiale genetico da una cellula all'altra con l'aiuto di speciali molecole di DNA circolari (plasmidi, in particolare, con l'aiuto di un plasmide F).

La probabilità di trasferimento di un determinato gene in una cellula ricevente dipende dalla sua rimozione dal DNA plasmidico F, o meglio, dal punto O, in cui inizia la replicazione del DNA plasmidico F. Più lungo è il tempo di coniugazione, maggiore è la probabilità di trasferimento di un dato gene. Ciò consente di creare una mappa genetica dei batteri in pochi minuti di coniugazione. Ad esempio, in E. coli, il gene thr (un operone di tre geni che controllano la biosintesi della treonina) si trova nel punto zero (cioè, direttamente accanto al DNA plasmidico F), il gene lac viene trasferito dopo 8 minuti, il gene recE - dopo 30 minuti, il gene argR - dopo 70 minuti, ecc.

Questo problema sarà considerato in modo più dettagliato quando si studia la genetica dei procarioti.

Mappatura cromosomica umana

La mappatura genica si basa sul raggruppamento di linkage. Più mutazioni conosciute e minore è il numero di cromosomi, più facile è mappare. A questo proposito, una persona (oltre al fatto che non può avere un'analisi ibrida classica) come oggetto è doppiamente sfavorevole per la mappatura: ha relativamente pochi geni conosciuti (almeno era così fino alla fine degli anni '70), e il numero aploide di cromosomi è abbastanza grande - 22 (sesso escluso). Ciò significa che la probabilità che due geni scoperti di recente vengano collegati è 1/22. Per questi motivi, l'analisi dei pedigree, che in una certa misura sostituisce l'analisi ibridologica, fornisce informazioni piuttosto limitate sulla natura del collegamento.

I metodi di genetica delle cellule somatiche si sono rivelati più promettenti per la mappatura dei geni umani. L'essenza di uno di loro è la seguente. Le tecniche di ingegneria cellulare consentono di combinare diversi tipi di cellule. La fusione di cellule appartenenti a diverse specie biologiche è chiamata ibridazione somatica. L'essenza dell'ibridazione somatica è ottenere colture sintetiche mediante fusione di protoplasti di vari tipi di organismi. Vari metodi fisico-chimici e biologici vengono utilizzati per la fusione cellulare. Dopo la fusione dei protoplasti, si formano cellule eterocariotiche multinucleate. Successivamente, durante la fusione dei nuclei, si formano cellule sincariotiche, contenenti set cromosomici di diversi organismi nei nuclei. Quando tali cellule si dividono in vitro, si formano colture cellulari ibride. Ibridi cellulari attualmente ottenuti e coltivati \u200b\u200b"umano × topo", "umano × ratto" e molti altri.

Nelle cellule ibride ottenute da diversi ceppi di specie diverse, uno dei set cromosomici parentali, di regola, si replica più velocemente dell'altro. Pertanto, quest'ultimo perde gradualmente i cromosomi. Questi processi avvengono intensamente, ad esempio, negli ibridi cellulari tra topi e esseri umani, specie che differiscono per molti marcatori biochimici. Se allo stesso tempo si segue un qualunque marker biochimico, ad esempio l'enzima timidina chinasi, e contemporaneamente si effettua il controllo citogenetico, identificando i cromosomi in cloni formati dopo la loro parziale perdita, allora, alla fine, la scomparsa di un cromosoma può essere associata contemporaneamente ad un tratto biochimico. Ciò significa che il gene che codifica per questo tratto è localizzato su questo cromosoma. Quindi, il gene della timidina chinasi negli esseri umani si trova sul cromosoma 17.

Alcune informazioni sulla localizzazione dei geni possono essere ottenute analizzando le mutazioni numeriche e strutturali dei cromosomi, dalla presenza in famiglie di cromosomi con variazioni morfologiche, e tenendo conto dei tratti ereditari. Allo stesso scopo vengono utilizzate anche monosomie parziali risultanti da delezioni. Tuttavia, in questi casi, va tenuto presente che a volte il gene in esame rimane nel frammento centrico, ma la sua manifestazione può essere fortemente indebolita a causa dell'effetto di posizione o di altri meccanismi regolatori (cambiamento nell'ordine di replicazione, distacco della regione del promotore, ecc.) ... Alla fine degli anni '60 è stato sviluppato un metodo di ibridazione in situ, che si basa sulla specificità delle interazioni complementari tra un gene e la sua copia (mRNA, nonché DNA complementare ottenuto mediante trascrizione inversa). La risoluzione di questo metodo è molto più alta sui cromosomi politenici che sui cromosomi mitotici umani, ma viene costantemente migliorata.

Mappatura genica mappatura genica, mappatura - mappatura genica.

Determinazione della posizione di un dato gene su un cromosoma rispetto ad altri geni; utilizzare tre gruppi principali di metodi Kg. - fisica (determinazione mediante mappe di restrizione, microscopia elettronica e alcune varianti di elettroforesi di distanze intergeniche - nei nucleotidi), genetica (determinazione delle frequenze di ricombinazioni tra geni, in particolare, in analisi familiare, ecc.) e citogenetica (ibridazione in situ<ibridazione in situ\u003e, ottenendo ibridi cellulari monosomiali<ibrido di cellule monocromosomiche\u003e, metodo di cancellazione<eliminazione mappatura\u003e ecc.); nella genetica umana, sono accettati 4 gradi di affidabilità della localizzazione di questo gene - confermati (stabiliti in due o più laboratori indipendenti o sul materiale di due o più oggetti di prova indipendenti), preliminari (1 laboratorio o 1 famiglia analizzata), contraddittori (discrepanza tra i dati di diversi ricercatori), dubbio (dati non finalizzati da un laboratorio); L'Appendice 5 fornisce una sintesi (dal 1992 al 1993) dei geni strutturali, degli oncogeni e degli pseudogeni nei genomi umani e - comprese alcune mutazioni - nei topi.

(Fonte: "The English-Russian Explanatory Dictionary of Genetic Terms." Arefiev VA, Lisovenko LA, Mosca: VNIRO Publishing House, 1995)

Scopri cos'è la "mappatura genica" in altri dizionari:

mappatura genica - Determinazione della posizione di un dato gene su un cromosoma rispetto ad altri geni; utilizzare tre gruppi principali di metodi K.g. fisica (determinazione mediante mappe di restrizione, microscopia elettronica e alcune varianti dell'elettroforesi ... ...

Mappatura genica - determinazione della posizione di un dato gene su un cromosoma rispetto ad altri geni. La mappatura genetica implica la determinazione delle distanze in base alla frequenza delle ricombinazioni tra i geni. La mappatura fisica utilizza alcune tecniche ... ... Dizionario di psicogenetica

mappatura [geni] usando il backcrossing - Metodo di mappatura genetica basato sull'ottenimento di ibridi di backcross di forme correlate e analisi della scissione di varianti di alleli, polimorfi in lunghezze di frammenti di restrizione; questo metodo è più comune nella mappatura genica in ... ... Guida del traduttore tecnico

Mappatura backcross mapping [geni] utilizzando backcrossing. Metodo di mappatura genetica basato sull'ottenimento di ibridi di backcross di forme correlate e analisi della scissione di varianti alleliche polimorfiche in lunghezza di restrizione ... ...

Mappatura di geni comparativi nei mammiferi - * cartovanne paranal geni of mammiferi * mappatura comparativa dei geni dei mammiferi confronto informativo delle mappe genetiche dell'uomo e di qualsiasi altra specie di mammiferi). Devono essere entrambi ben studiati e lontani l'uno dall'altro ...

Mappatura - * cartovanne * mappatura che stabilisce le posizioni dei geni o di alcuni siti specifici (vedi) lungo il filamento di DNA (. Mappa) ... Genetica. Dizionario enciclopedico

Mappatura con ibridi irradiati [cellule] - * cartografia per dapamogay della modificazione della mappatura ibrida irradiata ibrid [cell] * applicata del metodo di mappatura genica mediante ibridazione di cellule somatiche. Cellule del clone ibrido "roditore H umano" contenenti solo il cromosoma 1 ... ... Genetica. Dizionario enciclopedico

Mappatura ibrida di radiazione utilizzando ibridi [cellule] irradiati. Modifica del metodo di mappatura genica utilizzando cellule di ibridazione di cellule somatiche del clone ibrido “roditore ˟ umano” contenente solo 1 cromosoma ... ... Biologia molecolare e genetica. Dizionario esplicativo.

Stabilire l'ordine dei geni e la distanza relativa tra loro nel gruppo di collegamento ... Ampio dizionario medico

Mappatura del genoma umano

Non abbiamo bisogno di disturbare gli dei invano -

Ci sono gli interni delle vittime da indovinare sulla guerra,

Schiavi da tacere e pietre da costruire!

Osip Mandelstam, "La natura è la stessa Roma ..."

La genetica è una scienza giovane. L'evoluzione delle specie è stata realmente scoperta solo alla fine degli anni '50 del XIX secolo. Nel 1866, il monaco austriaco Gregor Mendel pubblicò i risultati dei suoi esperimenti sull'impollinazione dei piselli. Fino alla fine del secolo nessuno ha prestato attenzione alla sua scoperta. E Galton, per esempio, non li ha mai scoperti. Anche il meccanismo della fecondazione - la fusione dei nuclei delle cellule germinali maschili e femminili - fu scoperto solo nel 1875. Nel 1888 furono trovati piccoli corpi chiamati cromosomi nei nuclei delle cellule e nel 1909 i fattori ereditari mendeliani furono chiamati geni. La prima inseminazione artificiale (in un coniglio e poi nelle scimmie) è stata effettuata nel 1934; e infine, nel 1953, fu fatta una scoperta fondamentale: fu stabilita la struttura a doppia elica del DNA. Come puoi vedere, tutto questo è successo abbastanza di recente, quindi i primi eugenetici, in generale, erano molto poco consapevoli della tecnica del loro mestiere.

La mappatura del genoma umano è ancora nelle sue fasi iniziali. Ciò che sappiamo è una piccola frazione di ciò che non sappiamo. Esistono tre miliardi di sequenze nucleotidiche, che formano da ventisei a trentottomila geni, che codificano direttamente le proteine. Ma il modo in cui i geni e le proteine \u200b\u200bche producono interagiscono è ancora poco compreso.

Tuttavia, il ruolo dei geni nella società umana viene rapidamente riconosciuto. Nel 1998, Diana Paul (Università del Massachusetts) ha ricordato quello che quattordici anni fa aveva chiamato

La visione "biologicamente deterministica", secondo la quale i geni influenzano le differenze di intelligenza e temperamento - usando questi termini come se il loro significato fosse stato specificato. Oggi, il loro uso sarebbe controverso, poiché queste etichette sembrano mettere in discussione questo punto di vista, mentre è ampiamente accettato sia dagli scienziati che dal pubblico ".

Comunque sia, la nostra conoscenza viene reintegrata letteralmente ogni giorno e in un futuro molto prossimo saremo in grado di analizzare con grande precisione carico genetico,che imponiamo alle generazioni future.

Dal libro L'ultimo libro di fatti. Volume 1 [Astronomia e astrofisica. Geografia e altre scienze della terra. Biologia e Medicina] autore

Dal libro The Human Genome: An Encyclopedia Written in Four Letters autore

Dal libro The Human Genome [Encyclopedia Written in Four Letters] autore Tarantul Viacheslav Zalmanovich

Dal libro L'ultimo libro di fatti. Volume 1. Astronomia e astrofisica. Geografia e altre scienze della terra. Biologia e medicina autore Kondrashov Anatoly Pavlovich

Dal libro Decrypted Life [My Genome, My Life] di Venter Craig

Dal libro Biological Chemistry autore Lelevich Vladimir Valerianovich

Dal libro dell'autore

PARTE I. STRUTTURA DEL GENOMA UMANO CHE COS'È UN GENOMA? Le domande sono eterne, le risposte dipendono dal tempo. E. Chargaff In un dialogo con la vita, non è la sua domanda ad essere importante, ma la nostra risposta. MI Cvetaeva Fin dall'inizio definiremo cosa intendiamo qui con la parola "gene". Il termine stesso

Dal libro dell'autore

Analisi del DNA totale - nuove informazioni sulla struttura del genoma umano Nella prima fase dello studio diretto della struttura del genoma umano, quando la metodologia dell'ingegneria genetica non esisteva ancora, sono stati utilizzati metodi fisico-chimici tradizionali per studiare il DNA. NEL

Dal libro dell'autore

SECONDA PARTE. FUNZIONE DEL GENOMA UMANO LA REGINA È MORTA - ONORA LA REGINA! Ciò che sappiamo è limitato e ciò che non sappiamo è infinito. P. Laplace Science ha sempre torto. Non risolverà mai un problema senza sollevarne una dozzina di nuovi. B. Shaw So,

Dal libro dell'autore

Come è utile un computer per studiare il genoma umano? Senza le tecnologie di bioinformatica informatica (genoinformatica o, in un senso più ampio, bioinformatica), lo sviluppo della ricerca genomica sarebbe difficilmente possibile. È persino difficile immaginare come

Dal libro dell'autore

PARTE III. ORIGINE ED EVOLUZIONE DEL GENOMA UMANO

Dal libro dell'autore

Quanto è diverso il genoma umano dal genoma dello scimpanzé? Un genoma è una raccolta di geni contenuti in un set aploide (singolo) di cromosomi di un dato organismo. Il genoma non è una caratteristica di un individuo, ma di una specie di organismi. Nel febbraio 2001 in America

Dal libro dell'autore

Capitolo 11 Decifrare il genoma umano Cosa dirai quando, arrampicandoti con le ultime forze sulla cima di una montagna che nessuno ha mai visitato, vedrai improvvisamente una persona salire un sentiero parallelo? Nella scienza, la cooperazione è sempre molto più fruttuosa,