Genetické mapovanie. Stratégia genetického mapovania a jej úloha pri identifikácii nových génov dedičných chorôb Príklady genetického mapovania génov ľudských chorôb
Alfred Sturtevant (Morganov spolupracovník) navrhol, že frekvencia kríženia medzi génmi nachádzajúcimi sa na rovnakom chromozóme môže slúžiť ako miera vzdialenosti medzi génmi. Inými slovami, frekvencia kríženia vyjadrená ako pomer počtu jedincov kríženia k celkovému počtu jednotlivcov je priamo úmerná vzdialenosti medzi génmi. Križovatkovú frekvenciu je potom možné použiť na určenie relatívnej polohy génov a vzdialenosti medzi génmi.
Genetické mapovanie je určenie polohy génu vo vzťahu k (najmenej) dvom ďalším génom. Konštantnosť percenta kríženia medzi určitými génmi umožňuje ich lokalizáciu. Jednotka vzdialenosti medzi génmi je 1% kríženia; na počesť Morgana sa táto jednotka volá morganida (M) alebo santimorganid (CM).
V prvej fáze mapovania je potrebné určiť príslušnosť génu k väzbovej skupine. Čím viac génov je u daného druhu známych, tým presnejšie sú výsledky mapovania. Všetky gény sú rozdelené do väzbových skupín.
Počet väzbových skupín zodpovedá haploidnej skupine chromozómov. Napríklad v D. melanogaster 4 skupiny spojky, kukurica - 10, myši - 20, ľudia - 23 skupín spojky. Ak existujú pohlavné chromozómy, sú indikované dodatočne (napríklad osoba má 23 väzbových skupín plus chromozóm Y).
Počet génov vo väzbových skupinách spravidla závisí od lineárnych rozmerov zodpovedajúcich chromozómov. Ovocná muška má teda jeden (IV) bod (pri analýze pod svetelným mikroskopom) chromozóm. V súlade s tým je počet génov v ňom mnohonásobne menší ako vo zvyšku, čo ho výrazne dĺžkou výrazne prevyšuje. Je tiež potrebné poznamenať, že v heterochromatických oblastiach chromozómov gény chýbajú alebo takmer chýbajú; preto predĺžené oblasti konštitutívneho heterochromatínu môžu trochu zmeniť proporcionalitu počtu génov a dĺžku chromozómu.
Na základe genetického mapovania sú vypracované genetické mapy. Na genetických mapách extrémny gén (t. J. Najvzdialenejší od centroméry) zodpovedá nulovému (počiatočnému) bodu. Odľahlosť génu od nulového bodu je uvedená v morganidoch.
Ak sú chromozómy dostatočne dlhé, potom odstránenie génu z nulového bodu môže presiahnuť 50 M - potom vznikne rozpor medzi vzdialenosťami vyznačenými na mape presahujúcimi 50% a pozíciou uvedenou vyššie, podľa ktorej by 50% krížení získaných v experimente malo v skutočnosti znamenať absenciu väzby. tj. lokalizácia génov v rôznych chromozómoch. Tento rozpor sa vysvetľuje skutočnosťou, že pri zostavovaní genetických máp sa spočítajú vzdialenosti medzi dvoma najbližšími génmi, čo presahuje experimentálne pozorované percento kríženia.
KAZACHOVÁ NÁRODNÁ UNIVERZITA Pomenovaná PO AL-FARABI
Fakulty: biológia a biotechnológia
Oddelenie: biotechnológia
„ESSAY“
Na tému: GENETICKÁ SPOJKA A MAPOVANIE ĽUDSKÝCH GÉNOV.
Dokončené : 3-roční študenti (lekár.)
Nuralibekov S.Sh.
Davronova M.A.
Skontrolované : ph.D. , docent katedrymolekulárne
biológia a genetika Omirbekova N.Zh.
ALMATY 2018
Genetické väzbové mapy ……………………………………………………… ..3
Moderné metódy konštruovania máp genetického prepojenia …… .......... …… ...… .5
PCR v štúdiách na ľudskom genóme ……………………………… .... …………. …… 8
Fyzické mapy s nízkym rozlíšením ………………………………………… ..….… .9
Fyzické mapy s vysokým rozlíšením …………… .. ……………………… .. ……… 11
Zoznam použitých zdrojov ……………… ... …………… .. ………………… .13
Mapovanie a určenie primárnej štruktúry ľudského genómu
Po krátkom prehľade hlavných metód, ktoré sa v molekulárnej genetike najčastejšie používajú na štúdium štruktúry a mechanizmov fungovania génov, sa javí ako účelné bližšie sa pozrieť na praktické použitie týchto metód a ich modifikácií na štúdium veľkých genómov pomocou príkladu ľudského genómu. Aby bolo možné komplexne študovať ľudský genóm, toto kolosálne ukladanie jeho genetických informácií, bol nedávno vyvinutý a realizuje sa špeciálny medzinárodný program „Human Genome Project“. Hlavnou úlohou programu je konštrukcia komplexných genetických máp s vysokým rozlíšením pre každý z 24 ľudských chromozómov, ktoré by sa nakoniec mali dokončiť stanovením úplnej primárnej štruktúry DNA týchto chromozómov. V súčasnosti sú práce na projekte v plnom prúde. V prípade jeho úspešného dokončenia (a stane sa to v roku 2003) bude mať ľudstvo vyhliadky na dôkladné štúdium funkčného významu a mechanizmov fungovania každého z jeho génov, ako aj genetických mechanizmov, ktoré riadia ľudskú biológiu, a stanovenia príčin väčšiny patologických stavov jeho tela. ...
Základné prístupy k mapovaniu ľudského genómu
Riešenie hlavnej úlohy programu Ľudský genóm zahŕňa tri hlavné etapy. V prvom štádiu je potrebné každý jednotlivý chromozóm osobitným spôsobom rozdeliť na menšie časti, čo umožní ich ďalšiu analýzu známymi metódami. Druhá etapa výskumu zahŕňa stanovenie vzájomnej relatívnej polohy týchto jednotlivých fragmentov DNA a ich lokalizácie v samotných chromozómoch. V konečnej fáze je potrebné vykonať skutočné stanovenie primárnej štruktúry DNA pre každý z charakterizovaných fragmentov chromozómu a zostaviť úplnú súvislú sekvenciu ich nukleotidov. Riešenie problému nebude úplné, ak v nájdených nukleotidových sekvenciách nebude možné lokalizovať všetky gény organizmu a určiť ich funkčný význam. Prechod vyššie uvedenými tromi stupňami je potrebný nielen na získanie komplexných charakteristík ľudského genómu, ale aj akéhokoľvek iného veľkého genómu.
Mapy genetického prepojenia
Mapy genetického spojenia sú jednorozmerné vzory vzájomného usporiadania genetických markerov na jednotlivých chromozómoch. Genetické markery sa chápu ako akékoľvek zdedené fenotypové znaky, ktoré sa líšia u jednotlivých jedincov. Fenotypové znaky, ktoré vyhovujú požiadavkám genetických markerov, sú veľmi rozmanité. Zahŕňajú behaviorálne znaky alebo predispozíciu k určitým chorobám a morfologické znaky celých organizmov alebo ich makromolekúl, ktoré sa líšia štruktúrou. S vývojom jednoduchých a efektívnych metód na štúdium biologických makromolekúl sa také znaky, známe ako molekulárne markery, stali najčastejšie používanými pri konštrukcii máp genetickej väzby. Predtým, ako sa pristúpime k úvahám o metódach konštrukcie týchto máp a ich dôsledkoch na štúdium genómu, je potrebné pripomenúť, že termín „väzba“ sa v genetike používa na označenie pravdepodobnosti spoločného prenosu dvoch znakov z jedného rodiča na potomka.
Počas tvorby zárodočných buniek (gamét) u zvierat a rastlín v štádiu meiózy spravidla dochádza k synapse (konjugácii) homológnych chromozómov. Sesterské chromatidy homológnych chromozómov sú navzájom spojené po celej svojej dĺžke a v dôsledku kríženia (genetická rekombinácia medzi chromatidmi) dochádza k výmene ich častí. Čím ďalej sú dva genetické markery umiestnené navzájom na chromatide, tým je pravdepodobnejšie, že medzi nimi dôjde k prasknutiu chromatidu, ktoré je potrebné na kríženie, a dva markery v novom chromozóme patriacom do novej gaméty budú od seba oddelené, t. ich súdržnosť bude narušená. Jednotkou spojenia genetických markerov je morganida (Morganova jednotka, M), ktorá obsahuje 100 centimetrov (cM). 1 cM zodpovedá fyzickej vzdialenosti na genetickej mape medzi dvoma markermi, medzi ktorými rekombinácia nastáva s frekvenciou 1%. Vyjadrené v bázových pároch 1 cM zodpovedá 1 miliónu bp. (m.p.) DNA.
Mapy genetickej väzby správne odrážajú poradie, v akom sú genetické markery umiestnené na chromozómoch; získané hodnoty vzdialeností medzi nimi však nezodpovedajú skutočným fyzickým vzdialenostiam. Táto skutočnosť je zvyčajne spojená so skutočnosťou, že účinnosť rekombinácie medzi chromatidmi v jednotlivých oblastiach chromozómov sa môže veľmi líšiť. Je potlačený najmä v heterochromatických oblastiach chromozómov. Na druhej strane, rekombinačné horúce miesta sú bežné v chromozómoch. Použitie frekvencií rekombinácie na konštrukciu fyzikálnych genetických máp bez zohľadnenia týchto faktorov povedie k narušeniu (respektíve podhodnoteniu alebo nadhodnoteniu) skutočných vzdialeností medzi genetickými markermi. Mapy genetického spojenia sú teda najmenej presné zo všetkých dostupných typov genetických máp a možno ich považovať iba za prvé priblíženie skutočným fyzickým mapám. Napriek tomu v praxi práve oni umožňujú v prvých fázach štúdie lokalizovať zložité genetické markery (napríklad spojené s príznakmi ochorenia) a umožňujú ich ďalšie štúdium. Je potrebné pripomenúť, že pri absencii kríženia by sa všetky gény na individuálnom chromozóme preniesli z rodičov na potomkov spolu, pretože sú navzájom fyzicky spojené. Preto jednotlivé chromozómy tvoria väzbové skupiny génov a jednou z prvých úloh konštrukcie genetických väzbových máp je priradiť študovaný gén alebo nukleotidovú sekvenciu konkrétnej väzbovej skupine. V ďalšom. V tabuľke sú uvedené moderné metódy, ktoré podľa V.A. McCusick, sa najčastejšie používali na konštrukciu máp genetických väzieb až do konca roku 1990.
Moderné metódy konštruovania máp genetickej väzby
| Metóda | Počet mapovaných lokusov |
| Hybridizácia somatických buniek | 1148 |
| Hybridizácia in situ | 687 |
| Rodina | 466 |
| Stanovenie účinku dávky | 159 |
| Mapovanie obmedzení | 176 |
| Použitie chromozomálnych aberácií | 123 |
| Pomocou synthenia | 110 |
| Radiačne indukovaná segregácia génov | 18 |
| Iné metódy | 143 |
| Celkom | 3030 |
Hybridizácia somatických buniek. Jednou z najpopulárnejších metód priraďovania genetického markeru (funkčne aktívneho génu) k špecifickej väzbovej skupine je hybridizácia (fúzia medzi sebou) somatických buniek rôznych biologických druhov organizmov, z ktorých jeden je študovaný. U medzidruhových hybridov somatických buniek v procese kultivácie dochádza k strate chromozómov, hlavne jedného z biologických druhov. Strata chromozómov je spravidla náhodná a výsledné klony buniek obsahujú zvyšné chromozómy v rôznych kombináciách. Analýza klonov obsahujúcich rôzne sady chromozómov skúmaného druhu nám umožňuje určiť, s ktorými z týchto zostávajúcich chromozómov je spojená expresia študovaného markeru, a teda lokalizovať gén na konkrétnom chromozóme.
Hybridizácia in situ. Technika hybridizácie in situ sa tiež široko používa na mapovanie nukleotidových sekvencií na chromozómoch. Za týmto účelom sa prípravky fixovaných chromozómov hybridizujú (inkubujú sa pri zvýšenej teplote s následným ochladením) s vyšetrovanými nukleotidovými sekvenciami označenými rádioaktívnou, fluorescenčnou alebo inou značkou. Po premytí neviazanej značky sú zostávajúce označené molekuly nukleovej kyseliny asociované s chromozomálnymi oblasťami obsahujúcimi sekvencie komplementárne k študovaným značeným nukleotidovým sekvenciám. Výsledné hybridy sa analyzujú pomocou mikroskopu buď priamo, alebo po autorádiografii. Táto skupina metód sa vyznačuje vyšším rozlíšením ako hybridizácia somatických buniek, pretože umožňujú lokalizovať študované nukleotidové sekvencie na chromozómoch. Ako program Human Genome postupuje, majú vedci stále viac a viac izolovaných nukleotidových sekvencií, ktoré môžu byť použité ako sondy pre hybridizáciu in situ. V tomto ohľade sa tieto metódy z hľadiska frekvencie používania v poslednej dobe pevne osvedčili. Najpopulárnejšia je skupina metód nazývaná fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH), ktorá využíva polynukleotidové sondy obsahujúce fluorescenčnú značku. Konkrétne v roku 1996 bolo publikovaných viac ako 600 prác popisujúcich použitie tejto metódy.
Analýza rodinnej genetickej väzby. Táto skupina metód sa často používa v lekárskej genetike na identifikáciu spojenia (väzby) medzi príznakmi ochorenia spôsobeného mutáciou neznámeho génu a inými genetickými markermi. V tomto prípade samotné príznaky ochorenia pôsobia ako jeden z genetických markerov. V ľudskom genóme sa našlo veľké množstvo polymorfizmov vrátane RFLP. RFLP sú distribuované viac-menej rovnomerne v ľudskom genóme vo vzdialenosti 5–10 cm od seba. Čím bližšie sú jednotlivé polymorfné lokusy ku génu zodpovednému za chorobu, tým je menšia pravdepodobnosť ich separácie počas rekombinácie v meióze a tým častejšie sa vyskytujú spoločne u chorého jedinca a spoločne sa prenášajú z rodičov na potomkov. Po klonovaní rozšírenej genómovej oblasti vrátane zodpovedajúceho polymorfného markera (jej selekcia z knižnice klonov genómovej DNA sa uskutočňuje pomocou sondy) je možné súčasne s ňou izolovať gén, ktorý spôsobuje dedičné ochorenie. Takéto prístupy sa úspešne uplatnili najmä pri rodinnej analýze a izolácii zodpovedajúcich génov pri DMD, cystickej renálnej fibróze (cystickej fibróze) a myotonickej dystrofii. Informatívna hodnota jednotlivých RFLPs ľudského genómu závisí od úrovne ich heterozygozity v študovanej populácii. Za mieru informatívnosti RFLP ako genetického markera, ako ju navrhuje D. Botstein a kol. (1980), sa považuje hodnota informačného obsahu polymorfizmu (PIC), čo je pomer počtu krížení, v ktorých má najmenej jeden z rodičov študovaný polymorfný marker. v heterozygotnom stave, na všetky kríže.
Stanovenie účinku génovej dávky a použitie chromozomálnych aberácií ... Tieto metódy odhaľujú korelácie medzi úrovňou expresie študovaného génu a počtom špecifických chromozómov v aneuploidných bunkových líniách alebo štruktúrnymi prestavbami chromozómov (chromozomálne mutácie - aberácie). Aneuploidia je prítomnosť množstva chromozómov v bunke, tkanive alebo celom organizme, ktorá sa nerovná prítomnosti typickej pre daný biologický druh. Chromozomálne aberácie vo forme translokácií chromozómových oblastí do heterochromatických oblastí rovnakých alebo rôznych chromozómov sú často sprevádzané potlačením transkripcie génov nachádzajúcich sa v translokovaných oblastiach alebo v akceptorovom chromozóme (mozaikový efekt polohy).
Pomocou synthenia. Synténia je štrukturálna podobnosť skupín génových väzieb v organizmoch rôznych biologických druhov. Najmä niekoľko desiatok syntetických skupín génov je známych v ľudských a myších genómoch. Prítomnosť fenoménu synthénie umožňuje zúžiť hľadanie miesta lokalizácie študovaného génu na chromozómoch a obmedziť ho na oblasť známych génov patriacich do špecifickej syntetickej skupiny.
Génová segregácia vyvolaná ionizujúcim žiarením. Pri použití tejto metódy sa vzdialenosť medzi študovanými génmi stanoví hodnotením pravdepodobnosti ich separácie (segregácie) po ožiarení buniek určitou štandardnou dávkou ionizujúceho žiarenia. Ožiarené bunky sa pred smrťou zachránia hybridizáciou so somatickými bunkami hlodavcov a prítomnosť študovaných markerov ožarovaných buniek sa stanoví v somatických hybridoch v kultúre. Vo výsledku je možné dospieť k záveru o prítomnosti alebo neprítomnosti väzby (fyzickej vzdialenosti) medzi týmito génmi.
Medzi iné metódy Je potrebné spomenúť metódy založené na použití veľkých fragmentov DNA generovaných reštrikčnými enzýmami s veľkým štiepením na mapovanie génov. Po štiepení genómovej DNA sa výsledné fragmenty separujú elektroforézou v pulznom elektrickom poli a potom sa hybridizujú podľa Southern so sondami zodpovedajúcimi mapovaným génom. Ak sú po hybridizácii signály oboch sond lokalizované na rovnakom veľkom fragmente DNA, znamená to úzke spojenie týchto génov.
PCR v štúdiách na ľudskom genóme
Polymerázová reťazová reakcia je ústredná pri vývoji prístupov k praktickej implementácii programu ľudského genómu. Ako je diskutované vyššie, PCR môže rýchlo a efektívne amplifikovať takmer akúkoľvek krátku oblasť ľudského genómu a výsledné produkty PCR sa potom môžu použiť ako sondy na mapovanie zodpovedajúcich oblastí na chromozómoch južnou alebo in situ hybridizáciou.
Koncept STS. Jedným z kľúčových konceptov mapujúcich ľudské gény v rámci diskutovaného programu je koncept webov označených sekvenciami (STS). V súlade s týmto konceptom môžu byť všetky fragmenty DNA použité na konštrukciu genetických alebo fyzických máp jedinečne identifikované pomocou nukleotidovej sekvencie 200 - 500 bp, ktorá bude pre daný fragment jedinečná. Každé z týchto miest musí byť sekvenované, čo umožní ich ďalšiu amplifikáciu pomocou PCR a použitie ako sondy. Použitie STS by umožnilo použiť ich sekvencie vo forme produktov PCR ako sondy na cielenú izoláciu ľubovoľného fragmentu DNA konkrétnej genómovej oblasti zo súboru genómových sekvencií. Vďaka tomu je možné vytvoriť databázy, ktoré obsahujú lokalizáciu a štruktúru všetkých STS, ako aj priméry potrebné na ich amplifikáciu. To by eliminovalo potrebu laboratórií skladovať početné klony a posielať ich do iných laboratórií na výskum. STS navyše poskytujú základ pre vývoj jedného jazyka, v ktorom by rôzne laboratóriá mohli opísať svoje klony. Konečným výsledkom vývoja koncepcie STS by teda bola komplexná mapa STS ľudského genómu. Teoreticky je na zostavenie genetickej mapy o veľkosti 1 cm potrebných 3000 plne informatívnych, polymorfných markerov DNA. Pretože však polymorfné markery sú v genóme rozložené nerovnomerne a iba niektoré z nich sú plne informatívne, skutočný počet markerov potrebných na zostavenie mapy tejto veľkosti sa odhaduje na 30 - 50 tisíc. Na získanie markerov zodpovedajúcich oblastiam študovaných chromozómov sa často používajú primery zodpovedajúce dispergovaným opakujúcim sa sekvenciám, medzi ktorými sa ako prvé použili Alu sekvencie.
Alu-PCR.Rozptýlené opakované Alu sekvencie sú charakteristické pre ľudský genóm. Priméry špecifické pre Alu sekvencie sa používajú na amplifikáciu oblastí DNA ľudského genómu uzavretých medzi Alu repetíciami, ktoré sa nachádzajú v priemere vo vzdialenosti 4–10 kb. od seba. Ďalšou možnosťou pre Alu-PCR je cielená syntéza sond DNA s pomocou do oblastí chromozómov získaných po laserovej fragmentácii, jednotlivých chromozómov izolovaných pomocou prietokovej cytometrie alebo DNA hybridných buniek obsahujúcich určitú časť ľudského genómu. Alu-PCR sa navyše používa na získanie jedinečných odtlačkov prstov charakterizujúcich bunkové hybridy z hľadiska ich stability genómu, ako aj na charakterizáciu fragmentov ľudskej DNA klonovaných do YAC vektorov, kozmidov alebo vektorov na základe bakteriofágovej DNA. Jedinečnosť Alu sekvencií pre ľudský genóm umožňuje ich použitie na „prechádzanie po chromozómoch“, ako aj na rozširovanie existujúcich súborov. Pretože\u003e 90% mierne sa opakujúcich sekvencií v ľudskom genóme predstavuje rodina Alu a KpnI, nie je prekvapujúce, že tieto sekvencie sa tiež používajú v PCR na rovnaké účely ako Alu. Avšak tu sú profily produktov PCR menej zložité, pretože sekvencie KpnI sa v genóme menej často opakujú a majú charakteristickú lokalizáciu v chromozómoch.
PCR sa aktívne používa na identifikáciu polymorfných molekulárnych markerov pri konštrukcii máp genetickej väzby, ktorých základné princípy boli diskutované vyššie. Táto metóda je tiež užitočná pri sekvenovaní DNA, ako aj pri konštrukcii fyzických máp s vysokým rozlíšením pre ľudský genóm. Posledné dve oblasti použitia PCR budú podrobnejšie rozobrané nižšie.
Fyzické mapy s nízkym rozlíšením
Na rozdiel od vyššie popísaných genetických väzbových máp odrážajú fyzické mapy genómu skutočnú vzdialenosť medzi markermi, vyjadrenú v pároch báz. Fyzické mapy sa líšia stupňom ich rozlíšenia, t.j. o podrobnostiach štruktúry genómu, ktoré sú na nich prezentované. Komplexná fyzická mapa ľudského genómu s maximálnym rozlíšením bude obsahovať úplnú nukleotidovú sekvenciu všetkých jeho chromozómov. Na druhom konci fyzických máp s minimálnym rozlíšením sú chromozomálne (cytogenetické) mapy genómu.
Štyri typy genetických máp genómovej DNA a ich vzťah
1 - mapa genetickej väzby, 2 - mapa fyzických reštrikcií, medzery označujú miesta štiepenia DNA reštrikčnými enzýmami, 3 - mapa fyzických stránok, zobrazujúca prekrývajúce sa klony DNA získané pomocou vektorov YAC, 4 - komplexná mapa fyzických látok vo forme sekvencie nukleotidov DNA. Všetky mapy zobrazujú rovnakú oblasť chromozómov
Mapy chromozómov. Chromozómové mapy ľudského genómu sa získavajú lokalizáciou genetických markerov na jednotlivých chromozómoch pomocou cytogenetických metód vrátane autorádiografie a FISH. V posledných dvoch prípadoch boli pomocou svetelnej mikroskopie detekované rádioaktívne alebo fluorescenčné značky spojené so študovaným genetickým lokusom intaktných chromozómov. Nie je to tak dávno, čo chromozómové mapy umožnili lokalizovať študovaný fragment DNA na chromozóme s dĺžkou 10 mp. Moderné metódy hybridizácie in situ s použitím metafázových chromozómov, hlavne metóda FISH, lokalizujú polynukleotidové markery v rozmedzí 2–5 bp. Navyše počas hybridizácie in situ s medzifázovými chromozómami, v ktorých je genetický materiál v menej kompaktnej forme, sa rozlíšenie chromozómových máp blíži k 100 kbp.
Presnosť chromozómových máp sa zlepšuje aj pomocou moderných genetických metód. Napríklad schopnosť PCR amplifikovať segmenty DNA jednej bunky spermií umožňuje študovať veľké množstvo meiózy, akoby sa konzervovalo v jednotlivých vzorkách spermií. Výsledkom je, že je možné skontrolovať relatívnu polohu genetických markerov lokalizovaných na mapách chromozómov pomocou hrubších metód.
CDNA mapy... Mapy CDNA odrážajú polohu exprimovaných oblastí DNA (exónov) vzhľadom na známe cytogenetické markery (pásy) na metafázových chromozómoch. Pretože také mapy poskytujú predstavu o lokalizácii prepisovaných oblastí genómu, vrátane génov s neznámymi funkciami, dajú sa použiť na hľadanie nových génov. Tento prístup je obzvlášť užitočný pri hľadaní génov, ktorých poškodenie spôsobuje ľudské choroby, ak sa už na mapách genetickej väzby v dôsledku rodinnej genetickej analýzy uskutočnila približná lokalizácia takýchto oblastí chromozómov.
Fyzické mapy s vysokým rozlíšením
Dve stratégie pre budovanie fyzických máp DNA
a - stratégia „zhora nadol“: DNA celého chromozómu je štiepená restrikčnými enzýmami s veľkým štiepením, pre každý z jednotlivých fragmentov DNA je zostrojená reštrikčná mapa; b - stratégia zdola nahor, jednotlivé klony YAC sa po identifikácii spoja do kontigov
Pri pokusoch o vytvorenie máp ľudského genómu s vysokým rozlíšením boli experimentálne implementované dva alternatívne prístupy, ktoré sa nazývajú mapovanie zhora nadol a mapovanie zdola nahor. Pri mapovaní zhora nadol je počiatočnou analýzou príprava DNA individuálneho ľudského chromozómu. DNA sa štiepi restrikčnými enzýmami s veľkým štiepením (napr. NotI) na dlhé fragmenty, ktoré sa po separácii elektroforézou v pulznom elektrickom poli podrobia ďalšej reštrikčnej analýze s inými reštrikčnými enzýmami. Vďaka tomu sa získa makrorestrikčná mapa, na ktorej sú dostatočne úplne zastúpené všetky sekvencie študovaného chromozómu alebo jeho časti, ale jeho rozlíšenie je nízke. Na takejto mape je veľmi ťažké lokalizovať jednotlivé gény. Každá jednotlivá mapa navyše zriedka pokrýva predĺžené segmenty DNA (spravidla nie viac ako 1–10 mp).
Pri mapovaní ľudského genómu zdola nahor sa na základe prípravy celkovej DNA genómu alebo individuálneho chromozómu získa séria náhodných klonov predĺžených sekvencií DNA (10–1 000 kbp), z ktorých niektoré sa navzájom prekrývajú. V tomto prípade sa ako vektor na klonovanie často používajú umelé minichromozómy baktérií (BAC) alebo kvasiniek (YAC), ktoré sú podrobne opísané v časti 7.2.4. Séria čiastočne sa prekrývajúcich a komplementárnych klonov vytvára súvislú nukleotidovú sekvenciu DNA nazývanú kontig. Správnosť získaných kontigov potvrdzuje in situ hybridizácia (FISH) s ich súčasnou väzbou na určité oblasti študovaných chromozómov. Mapy založené na kontigoch poskytujú úplné informácie o štruktúre jednotlivých segmentov chromozómov a umožňujú vám lokalizovať jednotlivé gény. Takéto mapy sa však dajú ťažko použiť na rekonštrukciu celých chromozómov alebo ich predĺžených častí z dôvodu absencie zodpovedajúcich klonov v existujúcich knižniciach klonov génov.
Hlavným problémom, ktorý je potrebné vyriešiť pri použití oboch prístupov k konštrukcii fyzických máp s vysokým rozlíšením, je zjednotenie rozptýlených fragmentov DNA do súvislých nukleotidových sekvencií. Najčastejšie sa na to používajú špeciálne klonované fragmenty DNA, ktoré sa nazývajú spojovacie klony. Fragmenty DNA z väzbových klonov obsahujú nukleotidové sekvencie reštrikčných endonukleáz s veľkým štiepením vo svojich vnútorných častiach, a preto predstavujú spojenia fragmentov DNA použitých v prvých fázach fyzického mapovania. Southern hybridizáciou, počas ktorej sa ako sondy použijú fragmenty DNA viažucich klonov, sa určia fragmenty DNA fyzikálnych máp obsahujúcich nukleotidové sekvencie v blízkosti reštrikčných miest reštrikčných endonukleáz s veľkým štiepením. Ak sa nájdu dva také fragmenty, potom zodpovedajúci spojovací klon prekrýva oba tieto fragmenty a je ich súčasťou. Väzbové klony sú zase vybrané z génových bánk pomocou sond, ktoré sú nukleotidovými sekvenciami reštrikčných miest reštrikčných enzýmov s veľkým štiepením.
ZOZNAM POUŽITÉ ZDROJE
1) Clark M.S. Komparatívna genomika: Kľúč k porozumeniu projektu Human Genome Project // BioEssays. 1999. Zv. 21. S. 21-30.
2) Billings P.R., Smith C.L., Cantor C.L. Nové techniky fyzikálneho mapovania ľudského genómu // FASEB J. 1991. Zv. 5. S. 28–34.
3) Georgiev G.P. Gény vyšších organizmov a ich expresia. Moskva: Nauka, 1989,254 s.
4) http://referatwork.ru/refs/source/ref-8543.html
Krátko po znovuobjavení Mendelových zákonov predložil nemecký cytológ Theodor Boveri (1902) dôkazy o účasti chromozómov na procesoch dedičného prenosu, čo ukazuje, že normálny vývoj morského ježka je možný iba vtedy, ak sú v ňom všetky chromozómy. Americký cytológ William Setton súčasne (1903) upozornil na paralelizmus v správaní chromozómov pri meióze a hypotetické faktory dedičnosti, ktorých existenciu predpovedal už sám Mendel.
William Setton navrhol, že na jednom chromozóme možno nájsť niekoľko génov. V takom prípade by malo existovať spojené dedičstvo znakov, t.j. možno zdediť niekoľko rôznych znakov, akoby boli riadené jedným génom. V roku 1906 W. Batson a R. Pennett objavili spojené dedičstvo po sladkom hrášku. Študovali spoločné dedičstvo: farby kvetov (fialové alebo červené) a tvary peľových zŕn (predĺžené alebo okrúhle). Pri krížení diheterozygotov bol u ich potomkov pozorovaný štiepenie 11,1: 0,9: 0,9: 3,1 namiesto očakávaných 9: 3: 3: 1. Zdalo sa, že farebné a tvarové faktory peľu majú tendenciu zostať spolu počas rekombinácie sklonov. Autori tento fenomén nazvali „vzájomné priťahovanie faktorov“, nepodarilo sa im však zistiť jeho podstatu.
Ďalšie štúdium chromozómov ako nosičov informácií sa uskutočnilo v prvých desaťročiach 20. storočia v laboratóriu Thomasa Hunta Morgana (USA) a jeho spolupracovníkov (A. Sturtevant, C. Bridges, G. Möller). Morgan použil ako hlavný objekt výskumu ovocnú mušku Drosophila melanogaster, ktorá sa ukázala ako veľmi vhodný modelový objekt:
- Po prvé, táto muška sa ľahko pestuje v laboratórnych podmienkach.
- Po druhé, vyznačuje sa malým počtom chromozómov (2 n \u003d 8).
- Po tretie, v slinných žľazách lariev Drosophila sa nachádzajú obrovské (polyténové) chromozómy vhodné na priame pozorovanie.
- A nakoniec sa Drosophila vyznačuje vysokou variabilitou morfologických znakov.
Na základe experimentov s ovocnou muškou Drosophila Morgan a jeho študentmi bola vyvinutá teória chromozómov dedičnosti.
Hlavné ustanovenia chromozomálnej teórie dedičnosti:
1. Gén Je elementárnym dedičným faktorom (pojem „elementárny“ znamená „nedeliteľný bez straty kvality“). Gén je časť chromozómu, ktorá je zodpovedná za vývoj špecifickej vlastnosti. Inými slovami, gény sú lokalizované na chromozómoch.
2. Jeden chromozóm môže obsahovať tisíce génov usporiadaných lineárne (ako guľôčky na šnúrke). Tieto gény tvoria väzbové skupiny. Počet väzbových skupín sa rovná počtu chromozómov v haploidnej sade. Súbor alel na jednom chromozóme sa nazýva haplotyp. Príklady haplotypov: ABCD (iba dominantné alely), abcd (iba recesívne alely), AbCd (rôzne kombinácie dominantných a recesívnych alel).
3. Ak sú gény navzájom spojené, potom existuje účinok prepojenej dedičnosti znakov, t.j. niekoľko znakov sa dedí, akoby ich ovládal jediný gén. S prepojeným dedičstvom sa pôvodné kombinácie znakov zachovajú v postupnosti generácií.
4. Väzba génov nie je absolútna: vo väčšine prípadov si homologické chromozómy vymieňajú alely v dôsledku kríženia (kríženia) v profáze prvého meiotického delenia. V dôsledku kríženia sa vytvárajú krížové chromozómy (objavujú sa nové haplotypy, t.j. nové kombinácie alel.). Za účasti crossover chromozómov v nasledujúcich generáciách by sa u crossoverových jedincov mali objaviť nové kombinácie znakov.
5. Pravdepodobnosť nových kombinácií znakov v dôsledku kríženia je priamo úmerná fyzickej vzdialenosti medzi génmi. To vám umožní určiť relatívnu vzdialenosť medzi génmi a vytvoriť genetické (krížové) mapy rôznych druhov organizmov.
PREJSŤ
Crossover (z angl. Cross-over - Crossing) je proces výmeny homológnych oblastí homológnych chromozómov (chromatidov).
Kríženie sa zvyčajne vyskytuje pri meióze I.
Pri prechode dochádza k výmene genetického materiálu (alely) medzi chromozómami a potom dochádza k rekombinácii - vzniku nových kombinácií alel, napríklad AB + ab → Ab + aB.
Mechanizmus prechodu zlomením a zjednotením
Podľa teórie Janssens - Darlington, kríženie nastáva v profáze meiózy. Homologické chromozómy s AB a ab chromatidami tvoria dvojmocné látky. V jednej z chromatid v prvom chromozóme dôjde k prasknutiu v oblasti A - B, potom v susednom chromatide druhého chromozómu k prasknutiu v oblasti a - b. Bunka sa snaží napraviť poškodenie pomocou rekombinačných enzýmov a pripojiť fragmenty chromatidov. Avšak v tomto prípade je možné spojiť sa krížom (krížom) a vzniknú rekombinantné chromatidy Ab a aB. V anafáze prvej divízie meiózy dochádza k divergencii dichromatidových chromozómov a v druhej divízii divergencie chromatidov (jednomatromidové chromozómy). Chromatidy, ktoré sa nezúčastnili kríženia, si zachovávajú pôvodné kombinácie alel. Takéto chromatidy (jedno-chromatidové chromozómy) sa nazývajú nepriečne; s ich účasťou sa vyvinú nepretínajúce sa gamety, zygoty a jednotlivci. Rekombinantné chromatidy, ktoré sa tvoria počas kríženia, nesú nové kombinácie alel. Takéto chromatidy (jedno-chromatidové chromozómy) sa nazývajú krížené; s ich účasťou sa vyvinú krížené gaméty, zygoty a jednotlivci. V dôsledku prechodu teda nastáva rekombinácia - objavenie sa nových kombinácií dedičných sklonov v chromozómoch.
Podľa ďalších teórií je kríženie spojené s replikáciou DNA: buď v pachytene meiózy, alebo v medzifáze. Najmä je možné zmeniť matricu v replikačnej vidlici.
Genetické (krížové) mapy
Alfred Sturtevant (Morganov spolupracovník) navrhol, že frekvencia kríženia medzi génmi nachádzajúcimi sa na rovnakom chromozóme môže slúžiť ako miera vzdialenosti medzi génmi. Inými slovami, frekvencia kríženia, vyjadrená ako pomer počtu krížených jedincov k celkovému počtu jedincov, je priamo úmerná vzdialenosti medzi génmi. Prechodná frekvencia sa potom môže použiť na určenie relatívnej polohy génov a vzdialenosti medzi génmi. Jednotka vzdialenosti medzi génmi je 1% kríženia; na počesť Morgana sa táto jednotka nazýva morganida (M).
Na základe genetického mapovania genetické mapy - diagramy odrážajúce polohu génov v chromozómoch v porovnaní s inými génmi. Na genetických mapách extrémny gén (t. J. Najďalej od centroméry) zodpovedá nulovému (počiatočnému) bodu. Odľahlosť génu od nulového bodu je uvedená v morganidoch.
Konštrukcia genetických máp rôznych organizmov má veľký význam v zdravotníctve, chove a ekológii. Pri štúdiu vlastností človeka (najmä genetických chorôb) je dôležité vedieť, ktorý gén určuje danú vlastnosť. Tieto vedomosti umožňujú predvídať lekárske a genetické poradenstvo, vývoj metód liečby genetických chorôb, vč. a na korekciu genómu. Znalosti o genetických mapách kultúrnych rastlín a domácich zvierat umožňujú plánovanie procesu šľachtenia, čo prispieva k dosiahnutiu spoľahlivých výsledkov v krátkom čase. Konštrukcia genetických máp divých rastlín a divo žijúcich živočíchov je dôležitá aj z hľadiska ekológie. Vedec dostane predovšetkým príležitosť študovať nielen fenotypové znaky organizmov, ale aj špecifické, geneticky dané znaky.
Dvojitý a viacnásobný prechod
Morgan navrhol, že kríženie medzi dvoma génmi sa môže vyskytnúť nielen v jednom, ale aj v dvoch alebo dokonca viacerých bodoch. Párny počet krížení medzi dvoma génmi nakoniec nevedie k ich prenosu z jedného homológneho chromozómu do druhého; počet krížení, a teda aj vzdialenosť medzi týmito génmi stanovená v experimente klesá. Toto sa zvyčajne vzťahuje na gény umiestnené dosť ďaleko od seba. Pravdepodobnosť dvojitého kríža je samozrejme vždy nižšia ako pravdepodobnosť jedného kríža. V zásade sa bude rovnať súčinu pravdepodobnosti dvoch jednotlivých rekombinácií. Napríklad, ak sa vyskytne jeden kríž s frekvenciou 0,2, potom dvojitý kríž - s frekvenciou 0,2 × 0,2 \u003d 0,04. Neskôr, spolu s dvojitým prechodom, bol tiež objavený fenomén viacnásobného kríženia: homológne chromatidy si môžu vymieňať oblasti v troch, štyroch alebo viacerých bodoch.
Rušenie - toto je potlačenie prechodu v oblastiach bezprostredne susediacich s miestom výmeny, ku ktorej došlo.
Zvážte príklad opísaný v jednej z raných Morganových diel. Skúmal frekvenciu kríženia medzi génmi w (biele - biele oči), y (žlté - žlté telo) am (miniatúrne - malé krídla) lokalizované na X chromozóme D. melanogaster. Vzdialenosť medzi génmi w a y ako percento kríženia bola 1,3 a medzi génmi y a m - 32,6. Ak sú náhodne pozorované dve udalosti kríženia, potom by sa očakávaná dvojnásobná krížová frekvencia mala rovnať súčinu krížových frekvencií medzi génmi y a w a génmi w a m. Inými slovami, miera dvojitého výhybky bude 0,43%. V skutočnosti bol v experimente zistený iba jeden dvojitý prechod na 2205 múch, t. J. 0,045%. Morganov študent G. Möller navrhol kvantitatívne určiť intenzitu interferencie vydelením skutočne pozorovanej dvojitej krížovej frekvencie teoreticky očakávanou (pri absencii interferencie) frekvenciou. Tento ukazovateľ nazval koeficientom náhody, teda zhodou okolností. Möller ukázal, že interferencia v X chromozóme Drosophily je obzvlášť veľká na krátke vzdialenosti; s nárastom intervalu medzi génmi klesá jeho intenzita a na vzdialenosť asi 40 morganidov a viac koeficient súčinnosti dosahuje 1 (maximálna hodnota).
Cytologický dôkaz kríženia
Priamy cytologický dôkaz výmeny častí chromozómov počas kríženia bol získaný začiatkom 30. rokov v Drosophile a kukurici.
Zvážte Sternov experiment s D. melanogaster. Zvyčajne sú dva homologické chromozómy morfologicky nerozoznateľné. Stern skúmal chromozómy X, ktoré mali morfologické rozdiely, a preto neboli úplne homologické. Homológia medzi týmito chromozómami si však zachovala väčšinu svojej dĺžky, čo im umožnilo normálne párenie a segregáciu v meióze (to znamená normálne sa distribuovať medzi dcérske bunky). Jeden z X-chromozómov ženy v dôsledku translokácie, to znamená pohyb fragmentu Y-chromozómu, získal tvar v tvare L. Druhý chromozóm X bol kratší ako normálny, pretože jeho časť sa preniesla do chromozómu IV. Získali sa ženy, ktoré boli heterozygotné pre uvedené dva, morfologicky odlišné, X chromozómy, rovnako ako heterozygotné pre dva gény lokalizované na chromozóme X: Bar (B) a karafiát (cr). Gén Bar Je polodominantný gén, ktorý ovplyvňuje počet faziet, a teda aj tvar oka (mutanti s alelou B majú pásikavé oči). Gén cr riadi zafarbenie očí (alela cr + určuje normálne zafarbenie očí a alela cr určuje farbu očí červených karafiátov). Chromozóm X v tvare L niesol alely divokého typu B + a cr + a skrátený chromozóm niesol mutanty alel B a cr. Ženy uvedeného genotypu sa krížili s mužmi s morfologicky normálnym chromozómom X s alelami cr a B +. Potomstvo samíc obsahovalo dve triedy múch s nepriechodnými chromozómami (crB / crB + a cr + B + / crB +) a dve triedy mušiek, ktorých fenotyp zodpovedal kríženiu (crB + / crB + a cr + B / crB +). Cytologická štúdia ukázala, že jedinci kríženia si vymenili časti chromozómov X a podľa toho sa zmenil aj ich tvar. Všetky štyri triedy žien mali jeden normálny, to znamená chromozóm v tvare tyče, ktorý dostal od otca. Krížené samice obsiahnuté v ich karyotype X chromozómov sa transformovali v dôsledku kríženia - dlhá tyč alebo dvojramenná s krátkymi ramenami. Tieto experimenty, ako aj súčasne získané podobné výsledky na kukurici, potvrdili hypotézu Morgana a jeho spolupracovníkov, že kríženie predstavuje výmenu oblastí homológnych chromozómov a že gény sú skutočne lokalizované na chromozómoch.
Somatický (mitotický) prechod.
V somatických bunkách niekedy dochádza k výmene medzi chromatidami homológnych chromozómov, v dôsledku čoho sa pozoruje kombinovaná variabilita podobná tej, ktorá sa pravidelne vytvára meiózou. Homologické chromozómy sú často, zvlášť u drozofily a nižších eukaryotov, synapzované v mitóze. Jedna z autozomálne recesívnych mutácií u ľudí v homozygotnom stave, ktorá vedie k závažnému ochoreniu známemu ako Blumov syndróm, je sprevádzaná cytologickým obrazom, ktorý pripomína synapsiu homológov a dokonca aj tvorbu chiasmat.
Dôkazy o mitotickom prechode bola získaná na Drosophile analýzou variability znakov určených génmi y (žlté - žlté telo) a sn (ojedinelé - štetiny), ktoré sa nachádzajú na X chromozóme. Žena s genotypom y sn + / y + sn je heterozygotná pre gény y a sn, a preto bude pri absencii mitotického kríženia jej fenotyp normálny. Ak však k prechodu došlo v štádiu štyroch chromatidov medzi chromatidami rôznych homológov (ale nie medzi sesterskými chromatidami) a miesto výmeny je medzi génom sn a centromérou, potom sa tvoria bunky s genotypmi y sn + / y + sn + a y + sn / y + sn. V takom prípade bude mať sivé telo muchy s normálnymi štetinami dvojité mozaikové škvrny, z ktorých jedno bude žlté s normálnymi štetinami a druhé sivé s popálenými štetinami. Za týmto účelom je nevyhnutné, aby sa po prechode oba chromozómy (pôvodné chromatidy každého z homológov) y + sn presunuli do jedného pólu bunky a chromozómy y sn + do druhého. Potomkovia dcérskych buniek, množiace sa v pupálnej fáze, a povedú k vzniku mozaikových škvŕn. Mozaikové škvrny sa teda tvoria, keď sú dve skupiny (presnejšie dva klony) buniek umiestnené vedľa seba, fenotypicky sa líšiace od seba aj od buniek iných tkanív daného jedinca.
Nerovný prechod
Tento jav bol podrobne študovaný na príklade génu Bar (oči s pruhmi B), lokalizovanom na X chromozóme D. melanogaster. Nerovné kríženie je spojené s duplikáciou miesta v jednom z homológov a so stratou v inom homológu. Zistilo sa, že gén B môže byť prítomný vo forme tandemu, t. J. Nasledujúce po sebe opakujúce sa sekvencie pozostávajúce z dvoch alebo dokonca troch kópií. Cytologická analýza potvrdila predpoklad, že nerovnaké kríženie môže viesť k tandemovým duplikáciám. V oblasti zodpovedajúcej lokalizácii génu B bolo na preparátoch polyénových chromozómov zaznamenané zvýšenie počtu diskov úmerných dávke génu. Predpokladá sa, že v priebehu evolúcie nerovnomerné kríženie stimuluje vytváranie tandemových duplikácií rôznych sekvencií a ich použitie ako surového genetického materiálu na formovanie nových génov a nových regulačných systémov.
Krížová regulácia
Crossover Je zložitý fyziologický a biochemický proces, ktorý je pod genetickou kontrolou bunky a je ovplyvňovaný faktormi životného prostredia. Preto v skutočnom experimente môžeme hovoriť o križovatkovej frekvencii so zreteľom na všetky podmienky, v ktorých bola stanovená. Medzi heteromorfnými chromozómami X a Y neexistuje prakticky žiadne kríženie. Keby sa to stalo, potom by sa chromozómový mechanizmus určovania pohlavia neustále ničil. Blokovanie kríženia medzi týmito chromozómami je spojené nielen s rozdielom v ich veľkosti (nie je to vždy pozorované), ale aj s Y-špecifickými nukleotidovými sekvenciami. Predpokladom synapsie chromozómov (alebo ich častí) je homológia nukleotidových sekvencií.
Absolútna väčšina vyšších eukaryotov sa vyznačuje približne rovnakou frekvenciou kríženia u homogametického aj heterogametického pohlavia. Existujú však druhy, u ktorých Crossingover absentuje u jedincov heterogametického pohlavia, zatiaľ čo u jedincov homogametického pohlavia postupuje normálne. Táto situácia sa pozoruje u heterogametických samcov Drosophila a samíc priadky morušovej. Je nevyhnutné, aby frekvencia mitotického kríženia u týchto druhov bola u mužov a žien prakticky rovnaká, čo naznačuje rôzne prvky kontroly jednotlivých štádií genetickej rekombinácie v zárodočných a somatických bunkách. V heterochromatických oblastiach, najmä pericentromérnych oblastiach, je frekvencia kríženia znížená, a preto je možné meniť skutočnú vzdialenosť medzi génmi v týchto oblastiach.
Zistilo sa, že gény fungujú ako crossover blokátory, existujú však aj gény, ktoré zvyšujú jeho frekvenciu. U mužov Drosophila môžu niekedy vyvolať znateľný počet prechodov. Chromozomálne prešmyky, najmä inverzie, môžu tiež pôsobiť ako blokátory prechodu. Narúšajú normálnu konjugáciu chromozómov v zygoténe.
Zistilo sa, že frekvenciu kríženia ovplyvňuje vek tela, ako aj exogénne faktory: teplota, žiarenie, koncentrácia solí, chemické mutagény, lieky, hormóny. Pri väčšine týchto vplyvov sa zvyšuje frekvencia kríženia.
Všeobecne je kríženie jedným z bežných genetických procesov riadených mnohými génmi, a to priamo alebo prostredníctvom fyziologického stavu meiotických alebo mitotických buniek. Frekvencia rôznych typov rekombinácií (meiotické, mitotické kríženie a výmeny sesterských chromatíd) môže slúžiť ako miera pôsobenia mutagénov, karcinogénov, antibiotík atď.
Biologický význam prechodu
Vďaka prepojenému dedičstvu sú úspešné kombinácie alel relatívne stabilné. Vďaka tomu sa vytvárajú skupiny génov, z ktorých každý je ako jediný supergén, ktorý riadi niekoľko znakov. Zároveň pri prechode dochádza k rekombináciám - t.j. nové kombinácie alel. Takže kríženie zvyšuje kombinovanú variabilitu organizmov.
Evolučný význam prepojeného dedičstva. V dôsledku väzby môže jeden chromozóm obsahovať ako priaznivé alely (napríklad A), tak neutrálne alebo relatívne nepriaznivé (napríklad N). Ak určitý haplotyp (napríklad AN) zvyšuje zdatnosť svojich nosičov v dôsledku prítomnosti priaznivých alel A, potom sa v populácii akumulujú priaznivé alely aj neutrálny alebo relatívne nepriaznivý N s nimi spojené.
Príklad. Haplotyp AN má oproti haplotypu divokého typu (++) výhodu v dôsledku prítomnosti priaznivej alely A a potom sa alela N akumuluje v populácii, ak je selektívne neutrálna alebo dokonca relatívne nepriaznivá (ale jej negatívny vplyv na kondíciu je kompenzovaný pozitívnym účinkom alely A). ).
Evolučný význam prechodu. V dôsledku kríženia môžu nepriaznivé alely, pôvodne spojené s priaznivými, prejsť do iného chromozómu. Potom vznikajú nové haplotypy, ktoré neobsahujú nepriaznivé alely a tieto nepriaznivé alely sú z populácie eliminované.
Príklad. Al haplotyp sa ukazuje ako nepriaznivý v porovnaní s haplotypom „divokého typu“ (++) kvôli prítomnosti smrtiacej alely l. Alela A (priaznivý, neutrálny sliz mierne znižujúci kondíciu) sa preto nemôže prejaviť vo fenotype, pretože tento haplotyp (Al) obsahuje smrtiacu alelu l. V dôsledku kríženia sa objavujú rekombinantné haplotypy A + a + l. Haplotyp + l je vylúčený z populácie a haplotyp A + je pevný (aj keď alela A trochu znižuje vhodnosť jeho nosičov).
PRÍLOHY
Princípy genetického mapovania
Alfred Sturtevant (Morganov spolupracovník) navrhol, že frekvencia kríženia medzi génmi nachádzajúcimi sa na rovnakom chromozóme môže slúžiť ako miera vzdialenosti medzi génmi. Inými slovami, frekvencia kríženia, vyjadrená ako pomer počtu jedincov kríženia k celkovému počtu jednotlivcov, je priamo úmerná vzdialenosti medzi génmi. Prechodná frekvencia sa potom môže použiť na určenie relatívnej polohy génov a vzdialenosti medzi génmi.
Genetické mapovanie je určenie polohy génu vo vzťahu k (najmenej) dvom ďalším génom. Konštantnosť percenta kríženia medzi určitými génmi umožňuje ich lokalizáciu. Jednotka vzdialenosti medzi génmi je 1% kríženia; na počesť Morgana sa táto jednotka nazýva morganida (M).
V prvej fáze mapovania je potrebné určiť príslušnosť génu k väzbovej skupine. Čím viac génov je u daného druhu známych, tým presnejšie sú výsledky mapovania. Všetky gény sú rozdelené do väzbových skupín. Počet väzbových skupín zodpovedá haploidnej skupine chromozómov. Napríklad D. melanogaster má 4 väzbové skupiny, kukurica má 10, myši majú 20 a človek má 23 väzbových skupín. Počet génov vo väzbových skupinách spravidla závisí od lineárnych rozmerov zodpovedajúcich chromozómov. Takže ovocná muška má jeden (IV) bod (pri analýze pod svetelným mikroskopom) chromozóm. V súlade s tým je počet génov v ňom mnohonásobne nižší ako vo zvyšku, čo ho výrazne dĺžkou prevyšuje. Je tiež potrebné poznamenať, že v heterochromatických oblastiach chromozómov gény chýbajú alebo takmer chýbajú; preto predĺžené oblasti konštitutívneho heterochromatínu môžu trochu zmeniť proporcionalitu počtu génov a dĺžku chromozómu.
Genetické mapy sú zostavované na základe genetického mapovania. Na genetických mapách extrémny gén (t. J. Najďalej od centroméry) zodpovedá nulovému (počiatočnému) bodu. Odľahlosť génu od nulového bodu je uvedená v morganidoch.
Ak sú chromozómy dostatočne dlhé, potom odstránenie génu z nulového bodu môže presiahnuť 50 M - potom vznikne rozpor medzi vzdialenosťami vyznačenými na mape presahujúcimi 50% a pozíciou uvedenou vyššie, podľa ktorej by 50% krížení získaných v experimente malo v skutočnosti znamenať absenciu väzby. tj. lokalizácia génov v rôznych chromozómoch. Tento rozpor sa vysvetľuje skutočnosťou, že pri zostavovaní genetických máp sa spočítajú vzdialenosti medzi dvoma najbližšími génmi, čo presahuje experimentálne pozorované percento kríženia.
Cytogenetické mapovanie
Táto metóda je založená na použití chromozomálnych prešmykov. V prípade obrovských polyténových chromozómov umožňuje priame porovnanie výsledkov genetickej analýzy vzdialeností medzi študovanými lokusmi a ich relatívnej polohy s údajmi o fyzikálnych rozmeroch určitých chromozomálnych oblastí. Ožarovanie a pôsobenie iných mutagénov v chromozómoch často vedie k deléciám (deléciám) alebo inzerciám malých fragmentov porovnateľných s veľkosťou jedného alebo viacerých lokusov. Môžete napríklad použiť heterozygotov pre chromozómy, z ktorých jeden bude niesť skupinu po sebe nasledujúcich dominantných alel, zatiaľ čo homológny bude niesť skupinu recesívnych foriem rovnakých génov. Ak chromozóm s dominantnými génmi neustále stráca jednotlivé lokusy, potom sa v heterozygote objavia recesívne znaky. Poradie, v ktorom sa objavujú recesívne znaky, označuje poradie, v ktorom sa nachádzajú gény.
V poradí delenia génov AbC, v prípade delécie, ktorá zachytáva gén C, sa u mušiek so skráteným chromozómom, ktorý stratil fragment rovný génu C, vo fenotype objavia alely c, b a A.
Všeobecne porovnanie genetických (kríženie) a cytologických máp ukazuje ich korešpondenciu: čím väčšie percento kríženia oddeľuje pár génov, tým väčšia je medzi nimi fyzická vzdialenosť. Rozpor medzi vzdialenosťami určenými týmito dvoma metódami však môžu byť ovplyvnené dvoma faktormi. Po prvé, ide o oblasti, v ktorých je kríženie ťažké alebo absentujú (napríklad v heterochromatických oblastiach); po druhé, fyzická vzdialenosť bude väčšia ako genetická, ak sú gény oddelené zónou „tichej“ DNA. Mostové výpočty ukázali, že každá krížová jednotka na mape polyénových chromozómov slinných žliaz D. melanogaster zodpovedá dĺžke 4,2 μm polyténových chromozómov. Táto dĺžka sa rovná najmenej dvom až trom priemerným génom.
Vlastnosti stavby genetických máp u prokaryotov
Na vytváranie genetických máp u prokaryot sa používa fenomén konjugácie - prenos genetického materiálu z jednej bunky do druhej pomocou špeciálnych molekúl kruhovej DNA (plazmidy, najmä pomocou F-plazmidu).
Pravdepodobnosť prenosu určitého génu do bunky príjemcu závisí od jeho odstránenia z F - plazmidovej DNA, respektíve od bodu O, v ktorom začína replikácia F - plazmidovej DNA. Čím dlhší je čas konjugácie, tým vyššia je pravdepodobnosť prenosu daného génu. To umožňuje vytvoriť genetickú mapu baktérií v priebehu niekoľkých minút od konjugácie. Napríklad v E. coli sa gén thr (operón troch génov, ktoré riadia biosyntézu treonínu) nachádza v nulovom bode (tj. Priamo vedľa F - plazmidovej DNA), gén lac sa prenesie po 8 minútach, gén recE - po 30 minútach gén argR - po 70 minútach atď.
Tejto problematike sa budeme podrobnejšie venovať pri štúdiu genetiky prokaryot.
Mapovanie ľudského chromozómu
Génové mapovanie je založené na zoskupení väzieb. Čím známejšie mutácie a menší počet chromozómov, tým ľahšie sa mapujú. V tomto ohľade je človek (okrem toho, že nemôže mať klasickú hybridnú analýzu) ako objekt dvojnásobne nepriaznivý pre mapovanie: má relatívne málo známych génov (aspoň to tak bolo do konca 70. rokov) a haploidný počet chromozómov je dosť veľký - 22 (okrem pohlavia). To znamená, že pravdepodobnosť spojenia dvoch novoobjavených génov je 1/22. Z týchto dôvodov poskytuje analýza rodokmeňov, ktorá do istej miery nahrádza hybridologickú analýzu, pomerne obmedzené informácie o povahe odkazu.
Metódy genetiky somatických buniek sa ukázali ako perspektívnejšie pre mapovanie ľudských génov. Podstata jedného z nich je nasledovná. Techniky bunkového inžinierstva umožňujú kombinovať rôzne typy buniek. Fúzia buniek patriacich k rôznym biologickým druhom sa nazýva somatická hybridizácia. Podstatou somatickej hybridizácie je získanie syntetických kultúr fúziou protoplastov rôznych druhov organizmov. Na fúziu buniek sa používajú rôzne fyzikálno-chemické a biologické metódy. Po fúzii protoplastov sa vytvárajú viacjadrové heterokaryotické bunky. Následne počas fúzie jadier vznikajú synkaryotické bunky, ktoré obsahujú v jadrách chromozomálne sady rôznych organizmov. Keď sa také bunky delia in vitro, vznikajú hybridné bunkové kultúry. V súčasnosti sa získavajú a kultivujú bunkové hybridy „človek × myš“, „človek × potkan“ a mnoho ďalších.
V hybridných bunkách získaných z rôznych kmeňov rôznych druhov sa jedna zo skupín rodičovských chromozómov spravidla replikuje rýchlejšie ako druhá. Preto druhý z nich postupne stráca chromozómy. Tieto procesy sa intenzívne vyskytujú napríklad v bunkových hybridoch medzi myšami a ľuďmi - druhmi, ktoré sa líšia v mnohých biochemických markeroch. Ak súčasne sledujete akýkoľvek biochemický marker, napríklad enzým tymidínkinázu, a súčasne vykonávate cytogenetickú kontrolu identifikáciou chromozómov v klonoch vytvorených po ich čiastočnej strate, potom môže byť nakoniec zmiznutie chromozómu spojené súčasne s biochemickým znakom. To znamená, že gén kódujúci tento znak je lokalizovaný na tomto chromozóme. Takže gén tymidínkinázy u ľudí sa nachádza na chromozóme 17.
Niektoré informácie o lokalizácii génov je možné získať analýzou numerických a štrukturálnych mutácií chromozómov, výskytom v rodinách chromozómov s morfologickými variáciami a zohľadnením dedičných znakov. Na ten istý účel sa používajú aj čiastočné monozómy pochádzajúce z delécie. V týchto prípadoch si však treba uvedomiť, že študovaný gén niekedy zostáva v centrickom fragmente, ale jeho prejav môže byť výrazne oslabený v dôsledku pozičného efektu alebo niektorých ďalších regulačných mechanizmov (zmena poradia replikácie, odtrhnutie promótorovej oblasti atď.) ... Na konci 60. rokov bola vyvinutá metóda hybridizácie in situ, ktorá je založená na špecifickosti komplementárnych interakcií medzi génom a jeho kópiou (mRNA, ako aj komplementárna DNA získaná reverznou transkripciou). Rozlíšenie tejto metódy je oveľa vyššie na polyténových chromozómoch ako na ľudských mitotických chromozómoch, ale neustále sa zlepšuje.
Génové mapovanie génové mapovanie, mapovanie - génové mapovanie.
Určenie polohy daného génu na chromozóme v porovnaní s inými génmi; používajú tri hlavné skupiny metód K.g. - fyzikálne (stanovenie pomocou reštrikčných máp, elektrónová mikroskopia a niektoré varianty elektroforézy intergénnych vzdialeností - v nukleotidoch), genetické (stanovenie frekvencií rekombinácií medzi génmi, najmä pri rodinnej analýze atď.) a cytogenetické (hybridizácia in situ<hybridizácia in situ\u003e, získanie monozomálnych bunkových hybridov<monochromozomálny bunkový hybrid\u003e, metóda odstránenia<zmazanie mapovania\u003e atď.); v humánnej genetike sú akceptované 4 stupne spoľahlivosti lokalizácie tohto génu - potvrdené (stanovené v dvoch alebo viacerých nezávislých laboratóriách alebo na materiáli dvoch alebo viacerých nezávislých testovacích objektov), \u200b\u200bpredbežné (1 laboratórium alebo 1 analyzovaná rodina), rozporuplné (rozpor medzi údajmi od rôznych výskumníkov), pochybné (nedokončené údaje z jedného laboratória); Príloha 5 poskytuje súhrn (stav 1992 - 93) štruktúrnych génov, onkogénov a pseudogénov v ľudských genómoch a - vrátane niektorých mutácií - u myší.
(Zdroj: „Anglicko-ruský vysvetľujúci slovník genetických výrazov.“ Arefiev VA, Lisovenko LA, Moskva: Vydavateľstvo VNIRO, 1995)
Zistite, čo je „génové mapovanie“ v iných slovníkoch:
génové mapovanie - Určenie polohy daného génu na chromozóme v porovnaní s inými génmi; použite tri hlavné skupiny metód K.g. fyzikálne (stanovenie pomocou reštrikčných máp, elektrónovej mikroskopie a niektorých variantov elektroforézy ... ...
Génové mapovanie - stanovenie polohy daného génu na chromozóme v porovnaní s inými génmi. Genetické mapovanie zahŕňa určovanie vzdialeností podľa frekvencie rekombinácií medzi génmi. Fyzické mapovanie využíva niektoré techniky ... ... Slovník psychogenetiky
mapovanie [génov] pomocou spätného kríženia - Metóda genetického mapovania založená na získaní krížových krížencov príbuzných foriem a analýze štiepenia variantov alely, polymorfnej dĺžky reštrikčných fragmentov; táto metóda je najrozšírenejšia v génovom mapovaní v ... ... Sprievodca technickým prekladateľom
Mapovanie spätného kríženia mapovanie [génov] pomocou spätného kríženia. Metóda genetického mapovania založená na získaní krížových krížencov príbuzných foriem a analýze štiepenia alelických variantov polymorfných v reštrikčnej dĺžke ... ...
Mapovanie komparatívnych génov u cicavcov - * cartovanne paranálne gény cicavcov * komparatívne mapovanie génov cicavcov informatívne porovnanie genetických máp človeka a ktoréhokoľvek z ďalších druhov cicavcov). Musia byť obaja dobre študovaní a ďaleko od seba ...
Mapovanie - * cartovanne * mapovanie určujúce polohy génov alebo niektorých špecifických miest (pozri) pozdĺž reťazca DNA (. mapa) ... Genetika. encyklopedický slovník
Mapovanie s ožiarenými hybridmi [bunky] - * mapa dapamogay použitého hybrydў [bunka] * modifikácia hybridného mapovania vyžarovaná metódou génového mapovania pomocou hybridizácie somatických buniek. Bunky hybridného klonu "ľudský hlodavec H" obsahujúce iba chromozóm 1 ... ... Genetika. encyklopedický slovník
Radiačné hybridné mapovanie pomocou ožiarených hybridov [bunky]. Úprava metódy génového mapovania pomocou hybridizácie buniek somatických buniek hybridného klonu „hlodavec ˟ človek“ obsahujúceho iba 1 chromozóm ... ... Molekulárna biológia a genetika. Vysvetľujúci slovník.
Určenie poradia génov a relatívnej vzdialenosti medzi nimi v skupine väzieb ... Veľký lekársky slovník
Mapovanie ľudského genómu
Nemusíme zbytočne vyrušovať bohov -
Vnútri obetí je hádanie o vojne,
Otroci mlčia a kamene stavajú!
Osip Mandelstam, „Príroda je rovnaký Rím ...“
Genetika je mladá veda. Vývoj druhov bol skutočne objavený až na konci 50. rokov 19. storočia. V roku 1866 rakúsky mních Gregor Mendel zverejnil výsledky svojich pokusov o opelenie hrachu. Až do konca storočia jeho objavu nikto nevenoval pozornosť. A napríklad Galton sa o nich nikdy nedozvedel. Dokonca aj mechanizmus oplodnenia - fúzia jadier mužských a ženských zárodočných buniek - bol objavený až v roku 1875. V roku 1888 sa v jadrách buniek našli malé telieska, ktoré sa nazývajú chromozómy, a v roku 1909 sa mendelovské faktory dedičnosti nazývali gény. Prvé umelé oplodnenie (u králika a potom u opíc) sa uskutočnilo v roku 1934; a nakoniec v roku 1953 došlo k zásadnému objavu - bola založená dvojitá špirálová štruktúra DNA. Ako vidíte, všetko sa to stalo pomerne nedávno, takže prvopočiatkoví eugenici všeobecne veľmi málo vedeli o technike svojho remesla.
Mapovanie ľudského genómu je stále v počiatočných štádiách. To, čo vieme, je nepatrný zlomok toho, čo nevieme. Existujú tri miliardy nukleotidových sekvencií, ktoré tvoria od dvadsaťšesť do tridsaťosemtisíc génov, ktoré priamo kódujú proteíny. Ako však gény a proteíny, ktoré produkujú, interagujú, je stále zle pochopené.
Úloha génov v ľudskej spoločnosti je však rýchlo rozpoznateľná. V roku 1998 si Diana Paul (University of Massachusetts) spomenula na to, čomu pred štrnástimi rokmi hovorila
„Biologicky deterministický“ pohľad, podľa ktorého gény ovplyvňujú rozdiely v inteligencii a povahe - pomocou týchto výrazov akoby bol špecifikovaný ich význam. Dnes by ich použitie bolo kontroverzné, pretože sa zdá, že tieto označenia spochybňujú tento uhol pohľadu, zatiaľ čo je široko akceptovaný vedcami aj verejnosťou “.
Nech je to akokoľvek, naše vedomosti sú doplňované doslova každý deň a vo veľmi blízkej budúcnosti budeme schopní analyzovať s veľkou presnosťou genetická záťaž,ktoré ukladáme budúcim generáciám.
Z knihy Najnovšia kniha faktov. Zväzok 1 [Astronómia a astrofyzika. Geografia a ďalšie vedy o Zemi. Biológia a medicína] autor Z knihy Ľudský genóm: encyklopédia napísaná štyrmi písmenami autor Z knihy Ľudský genóm [encyklopédia napísaná štyrmi písmenami] autor Tarantul Viačeslav Zalmanovič Z knihy Najnovšia kniha faktov. Zväzok 1. Astronómia a astrofyzika. Geografia a ďalšie vedy o Zemi. Biológia a medicína autor Kondrashov Anatolij Pavlovič Z knihy Dešifrovaný život [Môj genóm, môj život] autor: Venter Craig Z knihy Biologická chémia autor Lelevich Vladimír Valerianovič Z autorovej knihy Z autorovej knihyČASŤ I. ŠTRUKTÚRA ĽUDSKÉHO GENÓMU ČO JE GENÓM? Otázky sú večné, odpovede závisia od času. E. Chargaff V dialógu so životom nie je dôležitá jej otázka, ale naša odpoveď. MI Tsvetaeva Od samého začiatku definujeme, čo tu rozumieme pod slovom „gén“. Samotný termín
Z autorovej knihyAnalýza celkovej DNA - nové informácie o štruktúre ľudského genómu V prvej etape priameho štúdia štruktúry ľudského genómu, keď metodika genetického inžinierstva ešte neexistovala, sa na štúdium DNA používali tradičné fyzikálno-chemické metódy. IN
Z autorovej knihy Z autorovej knihyČASŤ II. FUNKCIA ĽUDSKÉHO GENÓMU KRÁĽOVNÁ JE ZOMRETÁ - Cti Kráľovnú! To, čo vieme, je obmedzené a to, čo nevieme, je nekonečné. Veda P. Laplacea sa vždy mýli. Nikdy nevyrieši problém bez toho, aby vzniesla tucet nových. B. Shaw Takže,
Z autorovej knihyAko je počítač užitočný na štúdium ľudského genómu? Bez počítačových bioinformatických technológií (genoinformatika alebo v širšom zmysle bioinformatika) by bol rozvoj genomického výskumu ťažko možný vôbec. Je dokonca ťažké si predstaviť, ako na to
Z autorovej knihyČASŤ III. PÔVOD A VÝVOJ ĽUDSKÉHO GENÓMU
Z autorovej knihyAký odlišný je ľudský genóm od šimpanzieho? Genóm je súbor génov obsiahnutých v haploidnej (jedinej) sade chromozómov daného organizmu. Genóm nie je charakteristikou jednotlivca, ale druhu organizmov. Vo februári 2001 v americkom
Z autorovej knihyKapitola 11 Dešifrovanie ľudského genómu Čo poviete, keď z posledných síl vystúpite na vrchol hory, ktorú nikto nikdy nenavštívil, naraz uvidíte človeka, ktorý stúpa po paralelnej ceste? Vo vede je spolupráca vždy oveľa plodnejšia,
