Nga varet rezolucioni i mikroskopit? Rezolucioni dhe zmadhimi i mikroskopit

Mikroskopët përdoren për të zbuluar dhe studiuar mikroorganizmat. Mikroskopët e dritës janë krijuar për të studiuar mikroorganizmat që kanë një madhësi prej të paktën 0.2 mikronë (baktere, protozoa, etj.) Dhe mikroskopët elektronikë për të studiuar mikroorganizmat më të vegjël (viruset) dhe strukturat më të vogla të baktereve.
Moderne mikroskopët e dritës janë pajisje optike komplekse, trajtimi i të cilave kërkon njohuri të caktuara, aftësi dhe kujdes të madh.
Mikroskopët e dritës ndahen në mikroskopë studentorë, punues, laboratorikë dhe kërkimorë, që ndryshojnë në dizajn dhe optikë. Mikroskopët shtëpiakë (Biolam, Bimam, Mikmed) kanë emërtime që tregojnë se cilit grup i përkasin (C - student, R - punëtorë, L - laborator, I - hulumtim), kompleti i plotë tregohet me një numër.

Një mikroskop bën dallimin midis pjesëve mekanike dhe optike.
TE pjesa mekanikepërfshijnë: një trekëmbësh (i përbërë nga një bazë dhe një mbajtëse tubi) dhe një tub me një revolver të montuar mbi të për bashkimin dhe ndryshimin e objektivave, një fazë të mostrës për një përgatitje, pajisje për bashkimin e kondensatorit dhe filtrave të dritës, si dhe mekanizmat e vendosur në trekëmbësh për trashë (makro-mekanizëm, makroskrew) dhe të imët
(mikromekanizëm, mikroskidë) për lëvizjen e mbajtësit të fazës ose tubit.
Pjesa optike Mikroskopi përfaqësohet nga objektivat, syzet dhe një sistem ndriçimi, i cili nga ana tjetër përbëhet nga një kondensator Abbe i vendosur nën skenë, një pasqyrë me një anë të sheshtë dhe konkave, si dhe një ndriçues të veçantë ose të integruar. Objektivat janë të dehur në revole, dhe syri përkatës përmes të cilit vërehet imazhi është instaluar në anën e kundërt të tubit. Bëni dallimin midis tubave monokular (që ka një okular) dhe dylbi (që ka dy syze identike).

Diagrami skematik i mikroskopit dhe sistemit të ndriçimit

1. burimi i dritës;
2. mbledhësi;
3. Diafragma e fushës së irisit;
4. Pasqyrë;
5. Diafragma e hapjes së irisit;
6. Kondensatori;
7. Droga;
7. "Imazh i ndërmjetëm i zmadhuar real i përgatitjes, i formuar nga; lente;
7 "". Një imazh përfundimtar i fantazmës së zgjeruar të ekzemplarit që shihet përmes okularit;
8. Lente;
9. ikona e daljes nga lentet;
10. Diafragma fushore e okularit;
11. Pamësi i syrit;
12. Syri.

Rolin kryesor në blerjen e imazhit e luan lente... Ai ndërton një imazh të zgjeruar, real dhe të përmbysur të objektit. Pastaj kjo imazh zmadhohet më tej kur shikohet përmes okularit, i cili, si një lupë konvencionale, jep një imazh virtual të zmadhuar.
Zmadhimi Mikroskopi mund të përcaktohet përafërsisht duke shumëzuar zmadhimin e objektivit me zmadhimin e okularit. Sidoqoftë, zmadhimi nuk përcakton cilësinë e imazhit. Përcaktohet cilësia e imazhit, qartësia e saj rezolucioni i mikroskopit, d.m.th., aftësia për të dalluar veçmas dy pika të ndara ngushtë. Kufiri i rezolucionit - distanca minimale në të cilën këto pika janë ende të dukshme veçmas - varet nga gjatësia e valës së dritës, e cila ndriçon objektin dhe nga hapja numerike e lentes. Hapësira numerike, nga ana e saj, varet nga hapja këndore e objektivit dhe indeksi i thyerjes së mediumit që ndodhet midis thjerrëzës objektive ballore dhe ekzemplarit. Hapja këndore është këndi maksimal në të cilin rrezet që kalojnë përmes një objekti mund të hyjnë në lente. Sa më i madh të jetë hapja e diafragmës dhe sa më afër indeksit të thyerjes së mesit ndërmjet objektivit dhe ekzemplarit, indeksit të thyerjes së xhamit, aq më e lartë është rezolucioni i objektivit. Nëse supozojmë se hapja e kondensatorit është e barabartë me hapjen e lentes, atëherë formula e rezolucionit është si më poshtë:

ku R është kufiri i rezolucionit; - gjatësia e valës; NA është hapja numerike.

Të dallojë e dobishme dhe e padobishme rrit. Zmadhimi efektiv zakonisht është i barabartë me hapjen numerike të lentes, e zmadhuar 500 deri në 1000 herë. Zmadhimi më i lartë i syzit të syrit nuk zbulon detaje të reja dhe është i padobishëm.
Në varësi të mediumit ndërmjet objektivit dhe përgatitjes, ekzistojnë objektiva "të thatë" të zmadhimit të ulët dhe të mesëm (deri në 40 x) dhe zhytjes me një hapje dhe zmadhim maksimal (90-100 x). Një lente "e thatë" është një lente që ka ajër midis lentes së tij të përparme dhe përgatitjes.

Një tipar i objektivave të zhytjes është që një lëng zhytjeje të vendoset midis thjerrëzave ballore të një objektivi të tillë dhe përgatitjes, e cila ka një indeks thyerjeje të njëjtë me xhamin (ose afër tij), i cili siguron një rritje në hapjen numerike dhe zgjidhjen e objektivit. Uji i distiluar përdoret si një lëng zhytjeje për thjerrëzat e zhytjes në ujë, dhe vaj kedri ose një vaj special sintetik i zhytjes për thjerrëzat e zhytjes në vaj. Përdorimi i vajit sintetik të zhytjes është i preferueshëm, pasi parametrat e tij janë normalizuar më saktë dhe, ndryshe nga vaji i kedrit, ai nuk thahet në sipërfaqen e lentes së përparme të objektivit. Për lentet që veprojnë në rajonin ultraviolet të spektrit, glicerina përdoret si lëng i zhytjes. Në asnjë rast nuk duhet të përdorni zëvendësues të vajit të zhytjes dhe, në veçanti, vaj vazelinë.
** Një imazh i marrë me thjerrëza ka të meta të ndryshme: devijime sferike dhe kromatike, lakimi i fushës së imazhit, etj. Në thjerrëzat që përbëhen nga disa lente, këto të meta korrigjohen deri diku. Në varësi të shkallës së korrigjimit të këtyre mangësive, dallohen akromatet dhe apokromatet më komplekse. Në përputhje me rrethanat, lentet në të cilat korrigjohet lakimi i fushës së imazhit quhen planakromat dhe planapokromatë. Përdorimi i këtyre lenteve prodhon një imazh të mprehtë në të gjithë fushën, ndërsa imazhi i marrë me lente konvencionale nuk ka të njëjtën mprehtësi në qendër dhe në skajet e fushës së shikimit. Të gjitha karakteristikat e një lente janë zakonisht të gdhendura në tytën e tij: zmadhimi i tij, hapja, lloji i lentes (APO - apokromat, etj.); Lentet e zhytjes në ujë kanë emërtimin VI dhe një unazë të bardhë rreth kornizës në pjesën e poshtme të saj, lentet e zhytjes në vaj kanë emërtimin MI dhe një unazë të zezë.
Të gjithë objektivat janë krijuar për të punuar me një mbulesë 0,17 mm.
Trashësia e mbulesës së mbulesës është veçanërisht e rëndësishme për cilësinë e figurës kur punoni me sisteme të forta të thata (40x). Kur punoni me objektiva zhytjeje, mos përdorni gota mbulese më të trashë se 0.17 mm, sepse trashësia e xhamit të mbulesës mund të jetë më e madhe se distanca e punës së objektivit, dhe në këtë rast, nëse përpiqeni ta përqendroni objektivin në ekzemplar, lentja e objektit të përparmë mund të dëmtohet.
Qepallat përbëhen nga dy lente dhe gjithashtu janë të disa llojeve, secila prej të cilave përdoret me një lloj specifik të lenteve, duke eleminuar në mënyrë plotësuese papërsosmëritë e imazhit. Lloji dhe zmadhimi i okularit tregohen në kornizë.
Kondensatori është krijuar për t'u përqëndruar në përgatitjen e dritës nga ndriçuesi, e drejtuar nga pasqyra e mikroskopit ose ndriçuesit (në rastin e përdorimit të një ndriçuesi të bashkangjitur ose të integruar). Pjesë e kondensatorit është diafragma e hapjes, e cila është thelbësore për ndriçimin e duhur të preparatit.
Ndriçuesi përbëhet nga një llambë inkandeshente e tensionit të ulët me një filament të trashë, një transformator, një lente kolektori dhe një diafragmë fushe, në varësi të hapjes, e cila përcakton diametrin e fushës së ndriçuar në përgatitje. Pasqyra drejton dritën nga ndriçuesi në kondensator. Në mënyrë që të ruhet paralelizmi i trarëve nga ndriçuesi në kondensator, duhet të përdoret vetëm ana e sheshtë e pasqyrës.

Rregullimi i ndriçimit dhe fokusimi i mikroskopit

Cilësia e figurës varet shumë edhe nga ndriçimi i duhur. Ka disa mënyra të ndryshme për të ndriçuar një ekzemplar nën mikroskopi. Mënyra më e zakonshme është instalime të lehta sipas Koehlere cila është si më poshtë:
1) instaloni ndriçuesin kundër pasqyrës së mikroskopit;
2) ndizni llambën e ndriçuesit dhe drejtojeni dritën në një pasqyrë të sheshtë (!) Të mikroskopit;
3) vendosni përgatitjen në fazën e mikroskopit;
4) mbuloni pasqyrën e mikroskopit me një fletë letre të bardhë dhe përqendroni në të imazhin e filamentit të llambës, duke lëvizur mbajtësin e llambës në ndriçues;
5) hiqni fletën e letrës nga pasqyra;
6) mbyllni diafragmën e hapjes së kondensatorit. Duke lëvizur pasqyrën dhe duke lëvizur pak mbajtësen e llambës, imazhi i filamentit përqendrohet në diafragmën e hapjes. Distanca e ndriçuesit nga mikroskopi duhet të jetë e tillë që imazhi i filamentit të llambës të jetë i barabartë me diametrin e diafragmës së hapjes së kondensatorit (mund të vëzhgoni diafragmën e aperturës duke përdorur një pasqyrë të sheshtë të vendosur në anën e djathtë të bazës së mikroskopit).
7) hapni diafragmën e hapjes së kondensatorit, zvogëloni hapjen e diafragmës së fushës së ndriçuesit dhe zvogëloni ndjeshëm flakërimin e llambës;
8) në zmadhim të ulët (10x), duke parë përmes okularit, merret një imazh i mprehtë i përgatitjes;
9) duke e kthyer pak pasqyrën, transferoni imazhin e diafragmës së fushës, e cila duket si një vend i ndritshëm, në qendër të fushës së shikimit. Duke ulur dhe ngritur kondensatorin, ata arrijnë një imazh të mprehtë të skajeve të diafragmës së fushës në planin e përgatitjes (rreth tyre mund të shihet një kufi me ngjyrë);
10) hapni diafragmën e fushës së ndriçuesit në skajet e fushës së shikimit, rritni flakërimin e filamentit të llambës dhe pak (me 1/3) ulni hapjen e diafragmës së hapjes së kondensatorit;
11) Kur ndryshoni lentet, duhet të kontrolloni vendosjen e dritës.
Pas mbarimit të rregullimit të dritës sipas Koehler, është e pamundur të ndryshohet pozicioni i hapjes së kondensatorit të diafragmave të fushës dhe aperturës. Ndriçimi i preparatit mund të kontrollohet vetëm me filtra të dritës neutrale ose duke ndryshuar inkandeshencën e llambës duke përdorur një reostat. Hapja e tepërt e diafragmës së aperturës së kondensatorit mund të çojë në një rënie të ndjeshme të kontrastit të figurës dhe hapje të pamjaftueshme - në një përkeqësim të ndjeshëm të cilësisë së figurës (pamja e unazave të difraksionit). Për të kontrolluar hapjen e saktë të diafragmës së aperturës, është e nevojshme të hiqni grykën e syrit dhe, duke parë në tub, ta hapni në mënyrë që të mbulojë fushën e ndriçuar me një të tretën. Për ndriçimin e saktë të përgatitjes kur punoni me lente me zmadhim të ulët (deri në 10x), është e nevojshme të hiqni dhe hiqni thjerrëzën e sipërme të kondensatorit.
Vëmendje! Kur punoni me lente që japin zmadhim të lartë - me sisteme të forta të thata (40x) dhe zhytje (90x), në mënyrë që të mos dëmtoni lenten e përparme, përdorni teknikën e mëposhtme kur fokusoheni: shikoni nga ana, ulni thjerrëzën me një vidë makro gati për të kontaktuar me përgatitjen okulari, me makroskranë ngadalë ngrenë objektivin derisa të shfaqet imazhi, dhe me ndihmën e mikroskavës kryhet fokusimi përfundimtar i mikroskopit.

Kujdesi i mikroskopit

Kur punoni me mikroskop, mos përdorni forcë të madhe. Mos prekni me gishta sipërfaqen e lenteve, pasqyrave dhe filtrave të dritës.
Te mbrosh sipërfaqet e brendshme lente, si dhe prizmi i tubit nga pluhuri, gjithmonë duhet të lini okularin në tub. Kur pastroni sipërfaqet e jashtme të lenteve, hiqni pluhurin prej tyre me një furçë të butë të larë në eter. Nëse është e nevojshme, fshijini butësisht sipërfaqet e lenteve me një leckë të larë mirë, pa sapun, liri ose kambri të lagur pak me benzinë \u200b\u200btë pastër, eter ose një përzierje të veçantë për pastrimin e optikës. Nuk rekomandohet të fshihen optikat e lenteve me ksilen, pasi kjo mund të çojë në ngjitjen e tyre.
Nga pasqyrat me argjend të jashtëm, pluhurin mund ta hiqni vetëm duke e fryrë me një llambë gome. Ju nuk mund t'i fshini ato. Alsoshtë gjithashtu e pamundur të heqësh dhe çmontosh vetë lentet - kjo do të çojë në dëmtimin e tyre. Në fund të punës në mikroskop, është e nevojshme të hiqni me kujdes mbetjet e vajit të zhytjes nga thjerrëzat e përparme të objektivit siç përshkruhet më sipër. Pastaj ulni fazën (ose kondensatorin në mikroskopë me një fazë fikse) dhe mbuloni mikroskopin me një mbulesë.
Për të ruajtur pamjen e mikroskopit, është e nevojshme që ta fshini atë në mënyrë periodike me një leckë të butë të mbarsur lehtë me vazelinë pa acid dhe pastaj me një leckë të butë dhe të pastër të pastër.

Përveç mikroskopisë konvencionale të dritës, ekzistojnë metoda të mikroskopisë që lejojnë studimin e mikroorganizmave të pa ngjyrosur: kontrasti fazor , fushë e errët dhe ndriçues mikroskopia. Për të studiuar mikroorganizmat dhe strukturat e tyre, madhësia e të cilave është më e vogël se rezolucioni i një mikroskopi drite, përdorni

ph.D. Egorova O.V.,
ekspert i Standardit Shtetëror të Federatës Ruse për pajisjet optike

Mikroskopi është një nga instrumentet kryesore në kërkimin citologjik. Cilësia e punës së saj, si një sistem optik kompleks, përcaktohet nga tiparet teknologjike të pajisjes dhe elementeve të saj. Cilësia e imazhit përcaktohet kryesisht nga natyra e imazhit të përgatitjes nga fluksi i dritës që ka kaluar nëpër të. Sipas teorisë së formimit të imazhit në një mikroskop, krijuar në ndërmarrjen e Karl Zeiss nga matematicieni dhe fizikanti Ernst Abbe (1840-1905) [shfaqje] në 1872, imazhi është një kombinim i vetive difraksionale dhe të ndërhyrjes së dritës.

2005 u shpall viti i Abbe për kontributin e tij në zhvillimin e instrumenteve optike dhe për organizimin e Carl ZEISS Foundation, i cili bashkoi fabrikën e krijimit të instrumenteve Zeiss dhe fabrikën e qelqit Schott.

Të dyja këto veti ndikojnë në cilësinë e imazhit dhe besnikërinë e objektit në imazh, dhe August Köhler (1866-1948) publikoi udhëzime për ndriçimin e saktë të ekzemplarëve mikroskopikë në 1883.

Nga ana tjetër, cilësia e imazhit të një sistemi optik gjithashtu varet nga përsosja e tij teknologjike (prania e devijimeve të mbetura - shtrembërimet, defektet e xhamit), montimi dhe përqendrimi.

Rezolucioni është një karakteristikë e rëndësishme sasiore e cilësisë së imazhit. Shtrembërimet e mbetjeve shkaktojnë një rishpërndarje të energjisë së dritës në modelin e shpërndarjes, dhe defektet e brendshme të lenteve (dhe i gjithë sistemi optik i mikroskopit) çojnë në formimin e dritës së dëmshme të shpërndarë dhe shtrembërimin gjeometrik të modelit të shpërndarjes, të mbivendosur në imazhin optik, i cili zvogëlon rezolucionin dhe kontrastin e imazhit.

Fuqia zgjidhëse e një sistemi optik është veti e tij të përshkruajë veçmas dy pika ose dy vija të vendosura në hapësirën e objekteve. Masa e rezolucionit është distanca më e vogël lineare ose këndore midis dy pikave (vijave), imazhet e të cilave ndërtohen veçmas nga sistemi optik.

Një sistem optik konsiderohet të jetë i përsosur nëse rezolucioni është i kufizuar vetëm nga shpërndarja e dritës në skajet e tytës së lentes ose diafragmës së hapjes së kondensatorit. Përhapja e dritës, për shkak të natyrës valore të dritës, shqetëson përhapjen drejtvizore të dritës; pika e ndriçuar përshkruhet në formën e një vendi rrethor, të quajtur rrethi Ajror, i rrethuar nga unaza të errëta dhe të lehta me shkëlqim zvogëlues. Rreth 84% e energjisë së dritës përqendrohet në vendin qendror, 7% brenda pikës së parë të dritës dhe 9% në pjesën tjetër të unazave. Rrezja r (Fig. 1) i unazës së parë të errët në planin e figurës përcaktohet nga shprehja p \u003d 1,22λ f, / D (1), ku λ është gjatësia e valës së dritës; f, është gjatësia fokale e sistemit optik; D është diametri i hapjes aktive të sistemit (apertura).

Sasia r e barabartë me distancën midis qendrave të imazhit të dy pikave A dhe B; r mund të përcaktohet nga formula p \u003d 0.61λ / sin σ, , (2), ku σ, është këndi i hapjes në hapësirën e figurës.

Në λ \u003d 0,560 μm \u003d 560 nm p \u003d 0,34 / σ, ku r matur në mikrometra.

Imazhet e dy pikave të ndriçuara, të ndërtuara nga sistemi optik, janë dy njolla me buzë jo të mprehta. Ndërsa pikat afrohen njëra me tjetrën, njollat \u200b\u200bpreken, pastaj mbivendosen dhe pastaj bashkohen (Fig. 1).

Syri mund të shohë dy pika në planin e figurës veçmas në një distancë minimale të caktuar r midis tyre dhe ndryshimi i kërkuar në ndriçim në pikën minimale dhe dhe maksimumi A ose B. Ndjeshmëria e kontrastit për syrin e mesëm është 5%. Raporti i ndriçimit në pikë dhe te ndriçimi në pikë DHE ose AT arrin 85%.

Rezolucioni i sistemeve optike përcaktohet duke përdorur botë të ndërprera ose radiale të bëra në pllaka qelqi (Fig. 2). Goditjet e lehta ose sektorët zbatohen në mënyrë fotolitografike në një sfond të errët. Janë prodhuar shënjestra standarde të ndërprera të gjashtë numrave (për vlerësimin e rezolucionit të thjerrëzave të kamerës dhe pajisjeve dhe njësive të tjera optike) dhe numri botëror 0 për vlerësimin e autokollimimit të rezolucionit të objektivave të mikroskopit. Secila botë përbëhet nga 25 elementë, të dixhitalizuar përgjatë skajeve dhe secila ka katër grupe goditje me gjerësi goditje që ndryshojnë nga një element në tjetrin. Gjerësia e goditjes kuptohet si distanca boshtore midis dy shiritave ngjitur të errëta ose të lehta, domethënë gjerësia totale e vija të errëta dhe të lehta është e barabartë me gjerësinë e një goditje. Të gjitha botët standarde kanë një kontrast absolut të K \u003d 1.

Rezolucioni i objektivit të mikroskopit përcaktohet në mënyrë lineare. Për objektet jo vetëlëndësuese, kufiri i rezolucionit d \u003d λ / A (3), ku DHE - hapja numerike, e barabartë me prodhimin e indeksit të përthyerjes së mesit ndërmjet thjerrëzës dhe objektit dhe mëkat σ.

Kur vëzhgoni një strukturë periodike, distanca më e vogël d, sipas teorisë së Abbe, varet nga hapja e lentes dhe hapja e kondensatorit: d \u003d λ / (A + A k) , (4), ku A k është hapja numerike e kondensatorit.

Nëse hapja e kondensatorit është e barabartë me hapjen objektive, atëherë rezolucioni i mikroskopit për objektet vetëlëndësuese përcaktohet nga formula d \u003d λ / (2A) (5)

Tabela 1. Vlerat e llogaritura të rezolucionit të thjerrëzave
Dhe rreth	λ \u003d 400 nm		λ \u003d 550 nm			λ \u003d 700 nm
	R 1	R 2	R 1		R 2	R 1	R 2
0,025	8,0	9,76	11,0		17,08	13,42	14,0
0,075	2,67	3,25	3,67		5,69	4,47	4,67
0,10	2,0	2,44	2,75		4,27	3,36	3,5
0,12	1,67	2,03	2,29		3,56	2,8	2,92
0,20	1,0	1,22	1,3		1,67	1,75	2,13
0,25	0,8	0,98	1,10		1,71	1,34	1,4
0,30	0,67	0,81	0,92		1,42	1,12	1,17
0,40	0,5	0,61	0,66		1,07	0,84	0,87
0,45	0,44	0,54	0,62		0,95	0,74	0,78
0,50	0,4	0,49	0,55		0,85	0,67	0,7
0,65	0,31	0,37	0,42		0,66	0,52	0,54
0,75	0,27	0,32	0,36		0,57	0,45	0,47
0,80	0,25	0,305	0,34		0,53	0,42	0,44
0,85	0,23	0,29	0,32		0,5	0,39	0,41
0,90	0,22	0,27	0,31		0,47	0,37	0,39
0,95	0,21	0,26	0,29		0,45	0,35	0,37
1,0	0,126	0,126	0,174		0,221	0,174	0,221
1,20	0,105	0,105	0,145		0,184	0,145	0,184
1,25	0,101	0,101	0,139		0,177	0,139	0,177
1,30	0,097	0,097	0,134		0,17	0,134	0,17
1,40	0,09	0,09	0,124		0,158	0,124	0,158
1,45	0,087	0,087	0,120		0,152	0,120	0,152
Р 1 - llogaritja me formulën (5)				Р 2 - llogaritja sipas formulës (2)

Duhet të theksohet se sa më shumë studime delikate të kryhen, aq më e krahasueshme duhet të jetë cilësia e llogaritur e objektivit dhe kondensatorit (sistemi i ndriçimit). Për shembull, kërkimi i ri dhe mikroskopët universal "Axio Imager" kanë parimin llogaritjen e optikës IC2S, e cila barazon cilësinë e objektivit dhe sistemin e ndriçimit.

Nga formulat e mësipërme del se sa më e shkurtër të jetë gjatësia e valës së dritës dhe sa më e madhe të jetë hapja e objektivit, aq më e lartë është rezolucioni i objektivit të mikroskopit.

Për të rritur rezolucionin e mikroskopit, mund të përdoren lëngje zhytëse, të cilat mbushin hapësirën midis objektit në shqyrtim dhe objektivit të mikroskopit. Për shkak të kësaj, hapja numerike e objektivit të mikroskopit mund të rritet në 1.45, dhe distanca kufizuese e zgjidhur në λ \u003d 0.56 μm - në d \u003d 0.17 μm.

Rritja e rezolucionit ndikohet nga raporti i fluksit të dritës të kaluar përmes përgatitjes (hapja e kondensatorit) dhe e perceptuar nga objektivi (hapja objektive). Nëse përgatitja është në kontrast (pas përpunimit dhe ngjyrosjes në mënyrën e duhur), atëherë sipas parimit Kohler, kur rregulloni ndriçimin, lejohet të hapni diafragmën e hapjes së kondensatorit në hapjen numerike të objektivit ose duke përdorur diafragmën e irisit madhësia e diafragmës së hapjes së kondensatorit mund të zvogëlohet nga diafragma3

Kështu, vlera e rezolucionit mund të llogaritet përkatësisht me formulën (5) dhe me formulën (2). Prandaj, kur punoni me lentet A \u003d 1.25, mund të përdorni një kondensator me hapje numerike A \u003d 0.9 (e thatë, rezolucioni llogaritet nga formula 2) dhe A \u003d 1.25 (zhytja, rezolucioni llogaritet me formulën 5) , por mos harroni se për të marrë A \u003d 1.25 është e nevojshme të "pikoni" vajin e zhytjes mbi kondensatorin.

Tabela 1 tregon vlerat e llogaritura të rezolucionit të thjerrëzave që përdoren tradicionalisht për kërkime biomjekësore.

Në fig. 3 tregon shembuj të imazheve me një mikroskop të rregulluar saktë (a) dhe me një rregullim të pasaktë të sistemit të ndriçimit të mikroskopit (b, c). Siç mund ta shihni, një cilësim i pasaktë ndikon në rezolucionin e mikroskopit, si dhe saktësinë e transferimit të elementeve të përgatitjes në imazhin e tij.

Siç është përmendur tashmë, rezolucioni mund të rritet duke përdorur filtra ngjyrash. Blu, jeshile, e verdhë dhe e kuqe janë tradicionale. Sidoqoftë, nëse blu dhe jeshile ndikojnë në rritjen e rezolucionit, atëherë e verdha dhe e kuqja punojnë për të rritur kontrastin, domethënë ato rrisin ndryshimin midis mjedisit dhe ekzemplarit.

Kështu, rezolucioni në mikroskop ndikohet nga:

• parametrat e lenteve (hapja numerike e lenteve);
• aftësia për të rregulluar ndriçimin sipas Koehler (diafragmat e fushës dhe diafragmës së rregullueshme, lëvizja fokusuese e kondensatorit dhe mundësia e përqendrimit të tij, aftësia për të përqendruar fillin e llambës nëse llamba nuk është autocentrike);
• cilësia e optikës së mikroskopit (e llogaritur dhe teknologjike);
• përdorimi i filtrave të dritës në rajonin e gjatësisë së valës së shkurtër të spektrit (nga UV në jeshile).

Një burim: I.P. Shabalova, T.V. Dzhangirova, N.N. Volchenko, K.K. Pugachev. Atlasi citologjik: Diagnostifikimi i sëmundjeve të gjirit - M.-Tver: OOO "Shtëpia botuese" Triada ", 2005

Cilësia e imazhit të vendosur rezolucioni i mikroskopit, d.m.th. distanca minimale në të cilën optika e mikroskopit mund të dallojë veçmas dy pika të ndara ngushtë. rezolucioni varet nga hapja numerike e objektivit, kondensatorit dhe gjatësisë së valës së dritës që ndriçon përgatitjen. Hapja (hapja) numerike varet nga hapja këndore dhe indeksi i thyerjes së mjedisit që ndodhet midis thjerrëzave ballore të objektivit dhe kondensatorit dhe ilaçit.

Hapja e lentes këndore është këndi maksimal (AOB) në të cilin rrezet që kalojnë përmes ekzemplarit mund të hyjnë në lente. Apertura numerike objektive e barabartë me produktin e sinusit të gjysmës së hapjes këndore dhe indeksit të thyerjes së mesit midis rrëshqitjes dhe thjerrëzës objektive ballore. N.A. \u003d n sinα ku, N.A. - hapja numerike; n është indeksi i thyerjes së mesit ndërmjet përgatitjes dhe thjerrëzës; sinα është sinusi i këndit α i barabartë me gjysmën e këndit AOB në diagram.

Kështu, hapja e sistemeve të thata (midis thjerrëzës ballore të objektivit dhe ajrit të barnave) nuk mund të jetë më shumë se 1 (zakonisht jo më shumë se 0.95). Mediumi i vendosur midis ilaçit dhe thjerrëzës quhet lëng zhytjeje ose zhytje, dhe thjerrëzat e krijuara për të punuar me lëngun zhytës quhen zhytje. Me zhytje me një indeks të thyerjes më të lartë se ajri, është e mundur të rritet hapja numerike e objektivit dhe prandaj zgjidhja.

Hapësira numerike e lenteve është gjithmonë e gdhendur në montimet e tyre.
Rezolucioni i mikroskopit gjithashtu varet nga hapja e kondensatorit. Nëse e konsiderojmë hapjen e kondensatorit të barabartë me hapjen e lentes, atëherë formula e rezolucionit ka formën R \u003d λ / 2NA, ku R është kufiri i rezolucionit; λ është gjatësia e valës; N.A është hapja numerike. Mund të shihet nga kjo formulë që kur shikohet në dritë të dukshme (pjesa jeshile e spektrit - λ \u003d 550nm), rezolucioni (kufiri i rezolucionit) nuk mund të jetë\u003e 0.2μm

Efekti i hapjes numerike të një objektivi të mikroskopit në cilësinë e imazhit

Mënyrat për të përmirësuar rezolucionin optik

Zgjedhja e një këndi të madh të konit të dritës, si nga ana e thjerrëzës, ashtu edhe nga ana e burimit të dritës. Falë kësaj, është e mundur të mblidhni në lente rrezet e dritës më të thyer nga strukturat shumë të holla. Kështu, mënyra e parë për të rritur rezolucionin është përdorimi i një kondensatori, hapja numerike e së cilës korrespondon me hapjen numerike të objektivit.

Metoda e dytë është përdorimi i një lëngu zhytës midis thjerrëzës objektive ballore dhe rrëshqitjes së mbulesës. Kështu veprojmë në indeksin e thyerjes së mediumit n të përshkruar në formulën e parë. Vlera e tij optimale, e rekomanduar për lëngjet e zhytjes, është 1.51.

Lëngjet e zhytjes

Lëngjet e zhytjes janë të nevojshme për të rritur hapjen numerike dhe, në përputhje me rrethanat, për të rritur rezolucionin e thjerrëzave të zhytjes të projektuara posaçërisht për të punuar me këto lëngje dhe, në përputhje me rrethanat, të shënuara. Lëngjet zhytëse të vendosura midis objektit dhe ekzemplarit kanë një indeks të thyerjes më të lartë se ajri. Prandaj, rrezet e dritës, të devijuara nga detajet më të vogla të objektit, nuk shpërndahen, duke lënë përgatitjen dhe bien në lente, gjë që çon në një rritje të rezolucionit.

Ekzistojnë objektiva për zhytjen në ujë (të shënuar me një unazë të bardhë), zhytjen në vaj (unazën e zezë), zhytjen në glicerinë (unazën e verdhë), zhytjen monobromnaphthalene (unaza e kuqe). Në mikroskopinë e dritës të përgatitjeve biologjike, përdoren objektivat e zhytjes në ujë dhe vaj. Objektivat e veçantë të kuarcit të zhytjes në glicerinë transmetojnë rrezatim ultraviolet me valë të shkurtër dhe kanë për qëllim mikroskopinë ultravjollcë (të mos ngatërrohet me lumineshencën) (domethënë, për studimin e objekteve biologjike që thithin në mënyrë selektive rrezet ultraviolet). Objektivat e zhytjes në monobromonafalainë nuk përdoren në mikroskopinë e objekteve biologjike.

Uji i distiluar përdoret si një lëng zhytjeje për një lente zhytjeje në ujë, dhe vaj natyror (kedri) ose sintetik me një indeks të caktuar të thyerjes përdoret për zhytjen në vaj.

Ndryshe nga lëngjet e tjera të zhytjes zhytja në vaj është homogjen, pasi ka një indeks të thyerjes të barabartë ose shumë afër me atë të qelqit. Në mënyrë tipike, ky indeks i përthyerjes (n) llogaritet për një vijë spektrale specifike dhe një temperaturë specifike dhe tregohet në shishen e vajit. Kështu, për shembull, indeksi i thyerjes së vajit të zhytjes për punë me një gotë mbulesë për vijën spektrale D në spektrin e natriumit në temperaturë \u003d 20 ° C është 1.515 (nD 20 \u003d 1.515), për punë pa një gotë mbulesë (nD 20 \u003d 1.520).

Për të punuar me lente apokromatike, shpërndarja normalizohet gjithashtu, domethënë, ndryshimi në indekset e thyerjes për linja të ndryshme të spektrit.

Përdorimi i vajit sintetik të zhytjes është i preferueshëm, pasi parametrat e tij janë standardizuar më saktë dhe, ndryshe nga vaji i kedrit, ai nuk thahet në sipërfaqen e thjerrëzës së përparme të objektivit.

Duke marrë parasysh sa më sipër, në asnjë rast nuk duhet të përdorni zëvendësues të vajit të zhytjes dhe, në veçanti, vaj vazelinë. Në disa metoda të mikroskopisë, për të rritur hapjen e kondensatorit, një lëng zhytës (zakonisht ujë i distiluar) vendoset midis kondensatorit dhe kampionit.

Objektiv... Njohja me pajisjen e mikroskopit dhe përcaktimi i rezolucionit të tij.

Pajisjet dhe aksesorët: Mikroskopi, pllakë metalike me vrimë të vogël, pasqyrë ndriçuese, vizore me peshore.

Prezantimi

Një mikroskop përbëhet nga një objektiv dhe një okular, të cilat janë sisteme komplekse të lenteve. Rruga e rrezeve në mikroskop është treguar në Fig. 1, në të cilën objektivi dhe syri janë të përfaqësuar nga thjerrëzat e vetme.

Subjekti AB vendoset pak më larg nga fokusi kryesor i lentes F rreth ... Objektivi i mikroskopit jep një imazh real, të kundërt dhe të zmadhuar të objektit (AB në Fig. 1), i cili formohet prapa gjatësisë fokale të dyfishtë të objektivit. Imazhi i zmadhuar shikohet nga okulari si një zmadhues. Imazhi i objektit i parë përmes okularit, imagjinar, i kundërt dhe i zmadhuar.

Distanca midis fokusit të pasëm të lentes dhe fokusit të përparmë të okularit quhet hapësira optike e sistemit ose gjatësia optike e tubit mikroskopi .

Zmadhimi i mikroskopit mund të përcaktohet nga zmadhimi i objektivit dhe syrit:

N \u003d N rreth  N rreth \u003d ───── (1)

f rreth  f ok

ku N rreth dhe N rreth - zmadhimi i objektivit dhe i okularit, përkatësisht; D është distanca më e mirë e shikimit për një sy normal (~ 25 cm);  është gjatësia optike e tubit të mikroskopit; f rreth dhe f ne rregull - gjatësitë kryesore fokale të lenteve dhe okularit.

Kur analizojmë formulën (1), mund të konkludojmë se çdo objekt i vogël mund të shikohet në mikroskopë me zmadhim të lartë. Sidoqoftë, zmadhimi i dobishëm i dhënë nga mikroskopi është i kufizuar nga fenomenet difraksionale që bëhen të dukshme kur shikoni objekte që janë të krahasueshme në madhësi me gjatësinë e valës së gjatë të dritës.

Kufiri i Rezolucionit mikroskopi është distanca më e vogël ndërmjet pikave, imazhi i së cilës në mikroskop merret veçmas.

Sipas teorisë së Abbe, kufiri i rezolucionit të mikroskopit përcaktohet nga shprehja:

d \u003d ───── (2)

ku d është madhësia lineare e artikullit në fjalë;  është gjatësia e valës së dritës së përdorur; n është indeksi i thyerjes së mesit ndërmjet objektit dhe thjerrëzës;  është këndi midis boshtit optik kryesor të mikroskopit dhe rrezes kufitare (Fig. 2).

AT quhet sasia A \u003d nsin lente me hapje numerike , dhe reciproke e d është rezolucioni i mikroskopit ... Nga shprehja (2) rrjedh se rezolucioni i mikroskopit varet nga hapja numerike e objektivit dhe gjatësia e valës së dritës që ndriçon objektin në shqyrtim.

Nëse objekti është në ajër (n \u003d 1), atëherë në mikroskop është e mundur të dallohen pikat e objektit, distanca midis të cilave:

d \u003d

Për objektet mikroskopike, këndi është afër 90 gradë, pastaj sin  1, nga i cili rrjedh se në mikroskop është e mundur të ekzaminohen objektet në një distancë prej ~ 0.61. Në rastin e vëzhgimeve vizuale (ndjeshmëria maksimale e syrit bie në rajonin e gjelbër të spektrit të dukshëm  550 nm), objektet mund të shihen në mikroskop në një distancë prej ~ 300 nm.

Siç vijon nga shprehja (2), rezolucioni i mikroskopit mund të rritet duke ulur gjatësinë e valës së dritës që ndriçon objektin. Pra, kur fotografoni objekte në dritë ultraviolet ( ~ 250-300 nm), rezolucioni i mikroskopit mund të dyfishohet.

Lënda h vendosur pak përtej fokusit të përparmë të lentes. Lente jep reale, e kundërt, e zmadhuar Foto H’ e vendosur midis fokusit të përparmë të okularit dhe qendrës optike të okularit. Ky imazh i ndërmjetëm shikohet përmes okularit si një gotë zmadhuese. Syri i syrit jep imagjinar, i drejtpërdrejtë, i zmadhuar Foto H, e cila ndodhet në distancën më të mirë të shikimit S ≈ 25 cm nga qendra optike e syrit.

Ne e shqyrtojmë këtë imazh me sy, në retinën e tij a reale, bisedoj, zvogëlohet Foto.

Zmadhimi i mikroskopit - raporti i madhësisë së imazhit imagjinar me madhësinë e objektit të parë përmes mikroskopit:
... Shumëzoni numëruesin dhe emëruesin me madhësinë e figurës së ndërmjetme H’ :
... Kështu, zmadhimi i mikroskopit është i barabartë me produktin e zmadhimit objektiv herë të zmadhimit të syzit. Zmadhimi i lentes mund të shprehet përmes karakteristikave të mikroskopit duke përdorur ngjashmërinë e trekëndëshave kënddrejtë
ku L  optike gjatësia e tubit: distanca midis fokusit të pasëm të lentes dhe fokusit të përparmë të okularit (supozojmë se L >> F rreth). Zmadhimi i syrit
... Prandaj, zmadhimi i mikroskopit është:
.

4. Rezolucioni dhe kufiri i rezolucionit të mikroskopit. Dukuritë e difraksionit në mikroskop, koncepti i teorisë së Abbe.

Kufiri i rezolucionit të mikroskopitz - Kjo është distanca më e vogël midis dy pikave të një objekti të parë përmes mikroskopit, kur këto pika ende perceptohen veçmas. Kufiri i rezolucionit të një mikroskopi biologjik konvencional është në intervalin prej 3-4 mikronë. Rezolucioni mikroskopi quhet aftësia për të dhënë një imazh të veçantë të dy pikave të distancës së ngushtë të objektit të hetuar, domethënë është reciproke e kufirit të rezolucionit.

Difraksioni i dritës imponon një kufi në aftësinë për të dalluar detajet e objekteve kur shikohen përmes mikroskopit. Meqenëse drita nuk përhapet në një vijë të drejtë, por përkulet rreth pengesave (në këtë rast, objektet në fjalë), imazhet e detajeve të vogla të objekteve janë të paqarta.

Sugjeroi E. Abbe teoria e difraksionit e rezolucionit të mikroskopit... Le të jetë objekti që duam të shqyrtojmë përmes një mikroskopi të jetë një grilë difraksioni me një periudhë d... Atëherë detaji minimal i objektit që duhet të dallojmë do të jetë periudha e grilës. Difraksioni i dritës ndodh në grila, por diametri i objektivit të mikroskopit është i kufizuar, dhe në kënde të mëdha të difraksionit, jo e gjithë drita që kalon nëpër grila hyn në objektiv. Në realitet, drita nga objekti përhapet në lente në një kon të caktuar. Imazhi që rezulton është sa më afër origjinalit, aq më shumë maksima përfshihen në formimin e imazhit. Drita nga një objekt përhapet në lente nga një kondensator në formë koni i karakterizuar nga hapja këndore u - këndi në të cilin lentet janë të dukshme nga qendra e objektit në shqyrtim, domethënë këndi midis rrezeve ekstreme të rrezes konike të dritës që hyjnë në sistemin optik. Sipas E. Abbe, për të marrë një imazh të një grilë, madje edhe më të paqartë, rrezet e çfarëdo dy rendeve të modelit të difraksionit duhet të hyjnë në lente, për shembull, rrezet që formojnë maksimumin qendror dhe të paktën difraksionin e parë. Kujtojmë që për incidencën e zhdrejtë të rrezeve në grilën difraksionale, formula e saj kryesore është:. Nëse drita bie në një kënd , dhe këndi i difraksionit për maksimumi i parë është e barabartë
, atëherë formula merr formën
... Konstanta e grilës së difraksionit duhet të merret si kufiri i rezolucionit të mikroskopit, atëherë
, ku  është gjatësia e valës së dritës.

Siç mund ta shihni nga formula, një mënyrë për të zvogëluar kufirin e rezolucionit të një mikroskopi është përdorimi i dritës me një gjatësi vale më të shkurtër. Në këtë drejtim, përdoret një mikroskop ultravjollcë, në të cilin mikro-objektet shqyrtohen në rrezet ultraviolet. Shtrirja themelore optike e një mikroskopi të tillë është e ngjashme me atë të një mikroskopi konvencional. Dallimi kryesor qëndron në përdorimin e pajisjeve optike që janë transparente ndaj dritës UV dhe në tiparet e regjistrimit të imazhit. Meqenëse syri nuk percepton rrezatim ultraviolet (përveç kësaj, ajo djeg sytë, d.m.th. është i rrezikshëm për organin e shikimit), përdoren pllaka fotografike, ekranet lumineshente ose konvertuesit elektron-optik.

Nëse në hapësirën ndërmjet objektivit dhe gotës mbulesë të preparatit vendoset një medium i lëngshëm i veçantë i quajtur zhytje, atëherë kufiri i rezolucionit gjithashtu zvogëlohet:
ku n - indeksi absolut i thyerjes së zhytjes, A – hapja numerike objektive... Uji përdoret si zhytje ( n = 1.33), vaj kedri ( n \u003d 1.515), monobromonafalainë ( n = 1.66), etj. Për secilin lloj të zhytjes, bëhet një lente e veçantë dhe mund të përdoret vetëm me këtë lloj zhytjeje.

Një mënyrë tjetër për të ulur kufirin e rezolucionit të një mikroskopi është rritja e këndit të hapjes. Ky kënd varet nga madhësia e thjerrëzës dhe distanca nga subjekti në thjerrëza. Sidoqoftë, distanca nga objekti në lente nuk mund të ndryshohet në mënyrë arbitrare, është konstante për secilën lente dhe objekti nuk mund të afrohet. Në mikroskopët modernë, këndi i hapjes arrin 140 ° (përkatësisht, u/2 \u003d 70 o). Me këtë kënd, merren aperturat maksimale numerike dhe kufijtë e rezolucionit minimal.

Janë dhënë të dhëna për incidencë të zhdrejtë të dritës në një objekt dhe një gjatësi vale prej 555 nm, në të cilën syri i njeriut është më i ndjeshëm.

Ju lutemi vini re se okulari nuk ndikon aspak në rezolucionin e mikroskopit, por krijon vetëm një imazh të zgjeruar të objektivit.