De ce depinde rezoluția microscopului? Rezoluția și mărirea microscopului

Microscoapele sunt folosite pentru a detecta și studia microorganismele. Microscoapele cu lumină sunt concepute pentru a studia microorganismele care au o dimensiune de cel puțin 0,2 microni (bacterii, protozoare etc.) și microscopurile electronice pentru a studia microorganismele mai mici (viruși) și cele mai mici structuri ale bacteriilor.
Modern microscopii cu lumină sunt dispozitive optice complexe, a căror manipulare necesită anumite cunoștințe, abilități și mare grijă.
Microscoapele cu lumină sunt împărțite în microscopuri studențești, de lucru, de laborator și de cercetare, diferind prin design și optică. Microscoapele domestice (Biolam, Bimam, Mikmed) au denumiri care indică grupului din care fac parte (C - student, R - lucrători, L - laborator, I - cercetare), setul complet este indicat printr-un număr.

Un microscop face distincția între părțile mecanice și cele optice.
LA piesă mecanicăinclud: un trepied (format dintr-o bază și un suport pentru tub) și un tub cu un revolver atașat la acesta pentru atașarea și schimbarea obiectivelor, o probă pentru o pregătire, atașamente pentru atașarea unui condensator și a filtrelor de lumină, precum și mecanisme încorporate în trepied pentru grosiere (macro-mecanism, macrosurub) și fin
(micromecanism, microsur) pentru deplasarea suportului pentru scenă sau tub.
Partea optică Microscopul este reprezentat de obiective, oculare și un sistem de iluminare, care la rândul său constă dintr-un condensator Abbe situat sub scenă, o oglindă cu o parte plană și concavă, precum și un iluminator separat sau încorporat. Obiectivele sunt înșurubate în revolver, iar ocularul corespunzător prin care este observată imaginea este instalat pe partea opusă a tubului. Distingeți între tuburi monoculare (având un ocular) și binoculare (având două oculare identice).

Diagrama schematică a microscopului și a sistemului de iluminare

1. Sursă de lumină;
2. Colector;
3. Diafragma câmpului irisului;
4. Oglindă;
5. Diafragma diafragmei irisului;
6. Condensator;
7. Medicamentul;
7. "Imagine intermediară reală mărită a preparatului, formată din; lentilă;
7 "". O imagine finală fantomă mărită a exemplarului văzută prin ocular;
8. Lentila;
9. pictogramă ieșire obiectiv;
10. Diafragma de câmp a ocularului;
11. Ocular;
12. Ochiul.

Rolul principal în achiziția de imagini îl joacă obiectiv... El construiește o imagine mărită, reală și inversată a obiectului. Apoi, această imagine este mărită suplimentar atunci când este vizualizată prin ocular, care, ca o lupă convențională, oferă o imagine virtuală mărită.
Mărire Microscopul poate fi determinat aproximativ prin înmulțirea măririi obiectivului cu mărirea ocularului. Cu toate acestea, mărirea nu determină calitatea imaginii. Calitatea imaginii, claritatea ei, este determinată rezoluția microscopului, adică abilitatea de a distinge separat două puncte strâns distanțate. Limita de rezoluție - distanța minimă la care aceste puncte sunt încă vizibile separat - depinde de lungimea de undă a luminii care luminează obiectul și de diafragma numerică a obiectivului. Diafragma numerică, la rândul ei, depinde de diafragma unghiulară a obiectivului și de indicele de refracție al mediului situat între obiectivul frontal frontal și specimen. Diafragma unghiulară este unghiul maxim la care razele care trec printr-un obiect pot pătrunde în obiectiv. Cu cât diafragma este mai mare și cu atât indicele de refracție al mediului dintre obiectiv și specimen este mai apropiat de indicele de refracție al sticlei, cu atât rezoluția obiectivului este mai mare. Dacă presupunem că diafragma condensatorului este egală cu diafragma obiectivului, atunci formula de rezoluție este următoarea:

unde R este limita de rezoluție; - lungimea de undă; NA este diafragma numerică.

Distinge util și inutil crește. Mărirea efectivă este de obicei egală cu diafragma numerică a obiectivului, mărită de 500 până la 1000 de ori. Mărirea oculară mai mare nu dezvăluie detalii noi și este inutilă.
În funcție de mediul dintre obiectiv și pregătire, există obiective „uscate” de mărire mică și medie (până la 40x) și obiective de imersiune cu deschidere și mărire maximă (90-100x). Un obiectiv „uscat” este un obiectiv care are aer între obiectivul său frontal și preparat.

O caracteristică a obiectivelor de imersiune este că un lichid de imersie este plasat între lentila frontală a unui astfel de obiectiv și preparat, care are un indice de refracție la fel ca sticla (sau aproape de el), care asigură o creștere a diafragmei numerice și rezoluția obiectivului. Apa distilată este utilizată ca lichid de imersie pentru lentilele de imersie în apă și ulei de cedru sau ulei de imersie sintetic special pentru lentilele de imersie în ulei. Utilizarea uleiului sintetic de imersiune este de preferat, deoarece parametrii săi sunt normalizați mai exact și, spre deosebire de uleiul de cedru, nu se usucă pe suprafața lentilei frontale a obiectivului. Pentru lentilele care funcționează în regiunea ultravioletă a spectrului, glicerina este utilizată ca lichid de imersie. În niciun caz nu trebuie să utilizați surogate de ulei de imersie și, în special, ulei de vaselină.
** O imagine obținută cu lentile are diferite dezavantaje: aberații sferice și cromatice, curbura câmpului de imagine etc. La lentilele formate din mai multe lentile, aceste dezavantaje sunt corectate într-o oarecare măsură. În funcție de gradul de corectare a acestor neajunsuri, se disting obiective acromatice și apocromați mai complexi. În consecință, lentilele în care curbura câmpului de imagine este corectată se numesc planacromate și planapocromatice. Utilizarea acestor lentile produce o imagine clară pe întregul câmp, în timp ce imaginea obținută cu lentilele convenționale nu are aceeași claritate în centru și la marginile câmpului vizual. Toate caracteristicile unei lentile sunt de obicei gravate pe cilindrul său: mărire proprie, deschidere, tip de lentilă (APO - apocromat, etc.); lentilele cu imersie în apă au denumirea VI și un inel alb în jurul cadrului în partea inferioară, lentilele cu imersie în ulei au denumirea MI și un inel negru.
Toate obiectivele sunt concepute pentru a funcționa cu o alunecare de acoperire de 0,17 mm.
Grosimea lamelei este deosebit de importantă pentru calitatea imaginii atunci când se lucrează cu sisteme uscate puternice (40x). Când lucrați cu obiective de imersiune, nu utilizați ochelari de acoperire mai groși de 0,17 mm, deoarece grosimea sticlei de acoperire poate fi mai mare decât distanța de lucru a obiectivului și, în acest caz, dacă încercați să focalizați obiectivul pe specimen, obiectivul obiectivului frontal poate fi deteriorat.
Ocularele sunt formate din două lentile și sunt, de asemenea, de mai multe tipuri, fiecare dintre ele fiind utilizat cu un anumit tip de lentile, eliminând suplimentar imperfecțiunile imaginii. Tipul ocularului și mărirea sunt marcate pe cadru.
Condensatorul este conceput pentru a focaliza asupra pregătirii lumina de la iluminator, direcționată de oglinda microscopului sau iluminatorului (în cazul utilizării unui iluminator aerian sau încorporat). O parte a condensatorului este diafragma cu deschidere, care este esențială pentru iluminarea corectă a preparatului.
Iluminatorul este format dintr-o lampă incandescentă de joasă tensiune cu filament gros, un transformator, un obiectiv colector și o diafragmă de câmp, în funcție de deschidere, care depinde de diametrul câmpului iluminat de pe preparat. Oglinda direcționează lumina de la iluminator în condensator. Pentru a menține paralelismul grinzilor de la iluminator la condensator, ar trebui utilizată doar partea plană a oglinzii.

Reglarea iluminării și focalizarea microscopului

Calitatea imaginii este, de asemenea, foarte dependentă de iluminarea adecvată. Există mai multe moduri diferite de a ilumina un specimen la microscopie. Cel mai comun mod este instalații de lumină conform lui Koehlercare este după cum urmează:
1) instalați iluminatorul pe oglinda microscopului;
2) aprindeți lampa iluminatorului și direcționați lumina către o oglindă de microscop plat (!);
3) așezați preparatul pe scena microscopului;
4) acoperiți oglinda microscopului cu o foaie de hârtie albă și focalizați pe ea imaginea filamentului lămpii, deplasând suportul lămpii în iluminator;
5) scoateți foaia de hârtie din oglindă;
6) închideți diafragma deschiderii condensatorului. Prin mișcarea oglinzii și mișcarea ușoară a suportului lămpii, imaginea filamentului este focalizată pe diafragma diafragmei. Distanța iluminatorului de la microscop ar trebui să fie astfel încât imaginea filamentului lămpii să fie egală cu diametrul diafragmei diafragmei condensatorului (puteți observa diafragma diafragmei folosind o oglindă plată plasată în partea dreaptă a bazei microscopului).
7) deschideți diafragma diafragmei condensatorului, reduceți diafragma câmpului iluminatorului și reduceți semnificativ incandescența lămpii;
8) la mărire mică (10x), privind prin ocular, se obține o imagine clară a preparatului;
9) rotind ușor oglinda, transferați imaginea diafragmei câmpului, care arată ca un punct luminos, în centrul câmpului vizual. Coborând și ridicând condensatorul, realizează o imagine clară a marginilor diafragmei de câmp în planul preparatului (în jurul lor se vede o margine colorată);
10) deschideți diafragma de câmp a iluminatorului la marginile câmpului vizual, creșteți incandescența filamentului lămpii și reduceți ușor (cu 1/3) deschiderea diafragmei de deschidere a condensatorului;
11) La schimbarea obiectivelor, trebuie să verificați setarea luminii.
După terminarea reglării luminii în conformitate cu Koehler, este imposibil să se schimbe poziția condensatorului de deschidere a câmpului și diafragmele de deschidere. Iluminarea preparatului poate fi controlată numai cu filtre de lumină neutră sau prin schimbarea incandescenței lămpii cu ajutorul unui reostat. Deschiderea excesivă a diafragmei diafragmei condensatorului poate duce la o scădere semnificativă a contrastului imaginii și deschiderea insuficientă - la o deteriorare semnificativă a calității imaginii (apariția inelelor de difracție). Pentru a verifica deschiderea corectă a diafragmei de deschidere, este necesar să scoateți ocularul și, uitându-vă în tub, să-l deschideți astfel încât să acopere câmpul luminos cu o treime. Pentru iluminarea corectă a preparatului atunci când lucrați cu lentile cu mărire redusă (până la 10x), este necesar să deșurubați și să scoateți lentila superioară a condensatorului.
Atenţie! Când lucrați cu lentile care oferă mărire mare - cu sisteme puternice de uscare (40x) și imersiune (90x), pentru a nu deteriora obiectivul frontal, utilizați următoarea tehnică atunci când focalizați: privind din lateral, coborâți obiectivul cu un macrosurub aproape pentru a intra în contact cu preparatul, apoi, uitați-vă în ocularul, cu macroscopul ridică foarte încet obiectivul până când apare imaginea și cu microscopul se realizează focalizarea finală a microscopului.

Îngrijirea microscopului

Când lucrați cu microscopul, nu folosiți o forță mare. Nu atingeți cu degetele suprafața lentilelor, oglinzilor și filtrelor de lumină.
Pentru a proteja suprafețele interioare lentilele, precum și prisma tubului de praf, trebuie să lăsați întotdeauna ocularul în tub. Când curățați suprafețele exterioare ale lentilelor, îndepărtați praful de pe ele cu o perie moale spălată în eter. Dacă este necesar, ștergeți ușor suprafețele lentilelor cu o cârpă bine spălată, fără săpun, lenjerie sau cârpă ușor umezită cu benzină pură, eter sau un amestec special pentru curățarea opticii. Nu este recomandat să ștergeți optica lentilelor cu xilen, deoarece acest lucru poate duce la lipirea lor.
De la oglinzile cu argint exterior, puteți îndepărta praful doar suflându-l cu un bec de cauciuc. Nu le puteți șterge. De asemenea, este imposibil să deșurubați și dezasamblați singur obiectivele - acest lucru va duce la deteriorarea lor. La sfârșitul lucrării la microscop, este necesar să îndepărtați cu atenție rămășițele uleiului de imersie de pe lentila frontală a obiectivului, așa cum este descris mai sus. Apoi coborâți etapa (sau condensatorul în microscopurile cu o etapă fixă) și acoperiți microscopul cu un capac.
Pentru a păstra aspectul microscopului, este necesar să îl ștergeți periodic cu o cârpă moale ușor impregnată cu vaselină fără acid și apoi cu o cârpă moale, uscată și curată.

În plus față de microscopia convențională cu lumină, există metode de microscopie care vă permit să studiați microorganismele nepătate: contrast de fază , câmp întunecat și luminescent microscopie. Pentru a studia microorganismele și structurile lor, a căror dimensiune este mai mică decât rezoluția unui microscop cu lumină, utilizați

doctorat Egorova O.V.,
expert al Standardului de Stat al Federației Ruse pentru dispozitive optice

Microscopul este unul dintre instrumentele principale în cercetarea citologică. Calitatea muncii sale, ca sistem optic complex, este determinată de caracteristicile tehnologice ale dispozitivului și de elementele sale. Calitatea imaginii este determinată în primul rând de natura imaginii preparatului prin fluxul de lumină care a trecut prin ea. Conform teoriei formării imaginii la microscop, creată la întreprinderea lui Karl Zeiss de matematicianul și fizicianul Ernst Abbe (1840-1905) [spectacol] în 1872, imaginea este o combinație a proprietăților de difracție și de interferență ale luminii.

2005 a fost declarat anul lui Abbe pentru contribuția sa la dezvoltarea instrumentelor optice și pentru organizarea Fundației Carl ZEISS, care a unit fabrica de fabricare a instrumentelor Zeiss și fabrica de sticlă Schott.

Ambele proprietăți afectează calitatea imaginii și fidelitatea obiectului din imagine, iar August Köhler (1866-1948) a publicat ghiduri pentru iluminarea corectă a diapozitivelor microscopice în 1883.

Pe de altă parte, calitatea imaginii sistemului optic depinde și de perfecțiunea sa tehnologică (prezența aberațiilor reziduale - distorsiuni, defecte ale sticlei), de asamblare și centrare.

Rezoluția este o caracteristică cantitativă importantă a calității imaginii. Distorsiunile reziduale determină o redistribuire a energiei luminii în modelul de difracție, iar defectele interne ale lentilei (și întregul sistem optic al microscopului) duc la formarea luminii împrăștiate dăunătoare și a distorsionării geometrice a modelului de difracție, suprapus peste imaginea optică, ceea ce reduce rezoluția și contrastul imaginii.

Puterea de rezolvare a unui sistem optic este proprietatea sa de a descrie separat două puncte sau două linii situate în spațiul obiectelor. Măsura rezoluției este cea mai mică distanță liniară sau unghiulară dintre două puncte (linii), ale căror imagini sunt construite separat de sistemul optic.

Un sistem optic este considerat a fi perfect dacă rezoluția este limitată doar de difracția luminii de la marginile cilindrului obiectivului sau a diafragmei de deschidere a condensatorului. Difracția luminii, datorită naturii de undă a luminii, perturbă propagarea rectilinie a luminii; punctul luminos este descris ca o pată circulară numită cercul Airy înconjurat de inele întunecate și luminoase, cu luminozitate scăzută. Aproximativ 84% din energia luminii este concentrată în punctul central, 7% - în interiorul primului punct luminos și 9% - în inelele rămase. Rază r (Fig. 1) al primului inel întunecat din planul imaginii este determinat de expresie p \u003d 1,22λ f, / D (1), unde λ este lungimea de undă a luminii; f, este distanța focală a sistemului optic; D este diametrul deschiderii active a sistemului (deschidere).

Cantitatea r egală cu distanța dintre centrele imaginii a două puncte A și B; r poate fi determinată de formulă p \u003d 0,61 λ / sin σ, , (2), unde σ, este unghiul de deschidere în spațiul imaginii.

La λ \u003d 0,560 μm \u003d 560 nm p \u003d 0,34 / σ, unde r măsurată în micrometri.

Imaginile a două puncte luminoase, construite de sistemul optic, sunt două pete cu margini neuniforme. Pe măsură ce punctele se apropie una de cealaltă, petele se ating, apoi se suprapun și apoi se îmbină (Fig. 1).

Ochiul poate vedea două puncte în planul imaginii separat la o anumită distanță minimă r între ele și diferența necesară de iluminare în punctul minim și și maxima A sau B. Sensibilitatea la contrast pentru ochiul mediu este de 5%. Raportul de iluminare la punctul respectiv și la iluminarea din punct ȘI sau LA ajunge la 85%.

Rezoluția sistemelor optice este determinată folosind lumi punctate sau radiale realizate pe plăci de sticlă (Fig. 2). Liniile sau sectoarele de lumină sunt aplicate fotolitografic pe un fundal întunecat. Sunt produse ținte punctate standard de șase numere (pentru evaluarea rezoluției obiectivelor camerei și a altor dispozitive și unități optice) și numărul mondial 0 pentru evaluarea autocollimării rezoluției obiectivelor microscopului. Fiecare lume este formată din 25 de elemente, digitalizate de-a lungul marginilor și fiecare având patru grupuri de curse cu lățimea cursei care variază de la un element la altul. Lățimea cursei este înțeleasă ca distanța axială dintre două dungi închise sau deschise adiacente, adică lățimea totală a dungi întunecate și deschise este egală cu lățimea unei curse. Toate lumile standard au un contrast absolut de K \u003d 1.

Rezoluția obiectivului microscopului este determinată într-o măsură liniară. Pentru obiectele non-auto-luminoase, limita de rezoluție d \u003d λ / A (3), unde ȘI - diafragmă numerică, egală cu produsul indicelui de refracție n al mediului dintre lentilă și obiect și sin σ.

La observarea unei structuri periodice, cea mai mică distanță d, conform teoriei lui Abbe, depinde de diafragma obiectivului și de diafragma condensatorului: d \u003d λ / (A + A k) , (4), unde A k este deschiderea numerică a condensatorului.

Dacă diafragma condensatorului este egală cu diafragma obiectivă, atunci rezoluția microscopului pentru obiecte auto-luminoase este determinată de formula d \u003d λ / (2A) (5)

Tabelul 1. Valorile calculate ale rezoluției obiectivelor
Și despre	λ \u003d 400 nm		λ \u003d 550 nm			λ \u003d 700 nm
Și despre	R 1	R 2	R 1		R 2	R 1	R 2
0,025	8,0	9,76	11,0		17,08	13,42	14,0
0,075	2,67	3,25	3,67		5,69	4,47	4,67
0,10	2,0	2,44	2,75		4,27	3,36	3,5
0,12	1,67	2,03	2,29		3,56	2,8	2,92
0,20	1,0	1,22	1,3		1,67	1,75	2,13
0,25	0,8	0,98	1,10		1,71	1,34	1,4
0,30	0,67	0,81	0,92		1,42	1,12	1,17
0,40	0,5	0,61	0,66		1,07	0,84	0,87
0,45	0,44	0,54	0,62		0,95	0,74	0,78
0,50	0,4	0,49	0,55		0,85	0,67	0,7
0,65	0,31	0,37	0,42		0,66	0,52	0,54
0,75	0,27	0,32	0,36		0,57	0,45	0,47
0,80	0,25	0,305	0,34		0,53	0,42	0,44
0,85	0,23	0,29	0,32		0,5	0,39	0,41
0,90	0,22	0,27	0,31		0,47	0,37	0,39
0,95	0,21	0,26	0,29		0,45	0,35	0,37
1,0	0,126	0,126	0,174		0,221	0,174	0,221
1,20	0,105	0,105	0,145		0,184	0,145	0,184
1,25	0,101	0,101	0,139		0,177	0,139	0,177
1,30	0,097	0,097	0,134		0,17	0,134	0,17
1,40	0,09	0,09	0,124		0,158	0,124	0,158
1,45	0,087	0,087	0,120		0,152	0,120	0,152
Р 1 - calculul prin formula (5)				Р 2 - calcul conform formulei (2)

Trebuie remarcat faptul că cu cât sunt efectuate studii mai subtile, cu atât mai comparabilă ar trebui să fie calitatea calculată a obiectivului și a condensatorului (sistemul de iluminare). De exemplu, noile microscopuri universale de cercetare „Axio Imager” au principiul de calcul al opticii IC2S, care egalizează calitatea obiectivului și a sistemului de iluminare.

Din formulele de mai sus rezultă că cu cât lungimea de undă a luminii este mai mică și cu cât diafragma obiectivului este mai mare, cu atât rezoluția obiectivului microscopului este mai mare.

Pentru a crește rezoluția microscopului, pot fi utilizate lichide de imersiune, care umple spațiul dintre obiectul în cauză și obiectivul microscopului. Datorită acestui fapt, diafragma numerică a obiectivului microscopului poate fi mărită la 1,45, iar distanța limitată rezolvată la λ \u003d 0,56 μm - la d \u003d 0,17 μm.

Creșterea rezoluției este influențată de raportul fluxului de lumină trecut prin preparat (diafragma condensatorului) și perceput de obiectiv (diafragma obiectivă). Dacă preparatul este contrastant (după procesare și colorare în mod adecvat), atunci conform principiului Kohler, atunci când reglați iluminarea, este permisă deschiderea diafragmei diafragmei condensatorului la diafragma numerică a obiectivului sau folosind diafragma irisului, dimensiunea diafragmei diafragmei condensatorului poate fi redusă cu 1/3.

Astfel, valoarea rezoluției poate fi calculată atât prin formula (5), cât și prin formula (2), respectiv. Prin urmare, atunci când lucrați cu obiectivul A \u003d 1,25, puteți utiliza un condensator atât cu o deschidere numerică A \u003d 0,9 (uscat, rezoluția este calculată prin formula 2), cât și A \u003d 1,25 (imersie, rezoluția este calculată prin formula 5) , dar nu uitați că pentru a obține A \u003d 1,25 este necesar să „picurați” ulei de imersie pe condensator.

Masa 1 prezintă valorile calculate ale rezoluției obiectivelor utilizate în mod tradițional pentru cercetarea biomedicală.

În fig. 3 prezintă exemple de imagini cu un microscop corect ajustat (a) și cu o reglare incorectă a sistemului de iluminare al microscopului (b, c). După cum puteți vedea, o setare incorectă afectează rezoluția microscopului, precum și acuratețea transferului elementelor preparatului în imaginea sa.

După cum sa menționat deja, rezoluția poate fi mărită prin utilizarea filtrelor de culoare. Albastru, verde, galben și roșu sunt tradiționale. Cu toate acestea, în timp ce albastru și verde cresc rezoluția, galbenul și roșul funcționează pentru a crește contrastul, adică sporesc diferența dintre mediu și specimen.

Astfel, rezoluția la microscop este influențată de:

parametrii obiectivului (diafragma numerică a obiectivului);
capacitatea de a regla iluminarea în funcție de Koehler (diafragme reglabile de câmp și diafragmă, mișcarea de focalizare a condensatorului și posibilitatea centrării acestuia, capacitatea de a centra firul lămpii dacă lampa nu este autocentrantă);
calitatea opticii microscopului (calculată și tehnologică);
utilizarea filtrelor de lumină în regiunea cu lungime de undă scurtă a spectrului (de la UV la verde).

O sursă: I.P. Shabalova, T.V. Dzhangirova, N. N. Volchenko, K.K. Pugachev. Atlas citologic: Diagnosticul bolilor mamare - M.-Tver: OOO "Editura" Triada ", 2005

Calitatea imaginii determinat rezoluția microscopului, adică distanța minimă la care optica microscopului poate distinge separat două puncte strâns distanțate. rezoluția depinde de diafragma numerică a obiectivului, condensatorul și lungimea de undă a luminii care luminează preparatul. Diafragma numerică (deschiderea) depinde de diafragma unghiulară și de indicele de refracție al mediului situat între lentila frontală a obiectivului și condensator și medicament.

Deschidere lentilă unghiulară este unghiul maxim (AOB) la care razele care trec prin specimen pot pătrunde în obiectiv. Diafragmă numerică obiectivă este egal cu produsul sinusului jumătății diafragmei unghiulare și indicelui de refracție al mediului situat între diapozitiv și lentila frontală a obiectivului. N / A. \u003d n sinα unde, N.A. - diafragmă numerică; n este indicele de refracție al mediului dintre preparat și lentilă; sinα este sinusul unghiului α egal cu jumătate din unghiul AOB din diagramă.

Astfel, diafragma sistemelor uscate (între lentila frontală a obiectivului și aerul medicament) nu poate fi mai mare de 1 (de obicei nu mai mult de 0,95). Mediul plasat între medicament și lentilă se numește lichid de imersie sau imersie, iar un obiectiv conceput să funcționeze cu lichid de imersie se numește imersiune. Datorită scufundării cu un indice de refracție mai mare decât aerul, este posibilă creșterea diafragmei numerice a obiectivului obiectiv și, prin urmare, a rezoluției.

Diafragma numerică a lentilelor este întotdeauna gravată pe monturile lor.
Rezoluția microscopului depinde și de deschiderea condensatorului. Dacă considerăm deschiderea condensatorului egală cu deschiderea lentilei, atunci formula de rezoluție are forma R \u003d λ / 2NA, unde R este limita de rezoluție; λ este lungimea de undă; N.A este diafragma numerică. Din această formulă se poate observa că, atunci când este privită în lumină vizibilă (partea verde a spectrului - λ \u003d 550 nm), rezoluția (limita de rezoluție) nu poate fi\u003e 0,2 μm

Efectul diafragmei numerice a obiectivului microscopului asupra calității imaginii

Modalități de îmbunătățire a rezoluției optice

Alegerea unui unghi mare de con de lumină, atât din partea obiectivului, cât și din partea sursei de lumină. Datorită acestui fapt, este posibil să colectați mai multe raze de lumină refractate din structuri foarte subțiri din lentilă. Astfel, prima modalitate de creștere a rezoluției este utilizarea unui condensator, a cărui diafragmă numerică corespunde diafragmei numerice a obiectivului.

A doua metodă constă în utilizarea unui lichid de imersie între obiectivul frontal și alunecare. Acesta este modul în care acționăm asupra indicelui de refracție al mediului n, descris în prima formulă. Valoarea sa optimă, recomandată pentru fluidele de imersiune, este de 1,51.

Lichide de imersie

Lichide de imersie sunt necesare pentru a crește diafragma numerică și, în consecință, pentru a crește rezoluția lentilelor de imersie special concepute pentru lucrul cu aceste lichide și, în consecință, marcate. Lichidele de imersie plasate între obiectiv și specimen au un indice de refracție mai mare decât aerul. Prin urmare, razele de lumină, deviate de cele mai mici detalii ale obiectului, nu se împrăștie, părăsind preparatul și cad în lentilă, ceea ce duce la o creștere a rezoluției.

Există obiective pentru imersiunea în apă (marcată cu un inel alb), imersiunea în ulei (inelul negru), imersiunea în glicerină (inelul galben), imersiunea în monobromnaftalen (inelul roșu) În microscopia cu lumină a preparatelor biologice, se utilizează obiectivele imersiei în apă și ulei. Obiectivele speciale de cuarț ale imersiunii în glicerină transmit radiații ultraviolete cu unde scurte și sunt destinate microscopiei ultraviolete (nu trebuie confundate cu luminescența) (adică pentru studierea obiectelor biologice care absorb selectiv razele ultraviolete). Obiectivele imersiei cu monobromonaftalină nu sunt utilizate în microscopia obiectelor biologice.

Apa distilată este utilizată ca lichid de imersie pentru o lentilă de imersie în apă, iar uleiul natural (cedru) sau sintetic cu un anumit indice de refracție este utilizat pentru imersia în ulei.

Spre deosebire de alte fluide de imersie imersie în ulei este omogen, deoarece are un indice de refracție egal sau foarte apropiat de cel al sticlei. De obicei, acest indice de refracție (n) este calculat pentru o linie spectrală specifică și o temperatură specifică și este indicat pe sticla de ulei. Deci, de exemplu, indicele de refracție al uleiului de imersie pentru lucrul cu o sticlă de acoperire pentru linia spectrală D în spectrul de sodiu la temperatura \u003d 20 ° C este de 1,515 (nD 20 \u003d 1,515), pentru lucrul fără o sticlă de acoperire (nD 20 \u003d 1,520).

Pentru lucrul cu lentile apocromatice, dispersia este, de asemenea, normalizată, adică diferența de indici de refracție pentru diferite linii ale spectrului.

Utilizarea uleiului sintetic de imersiune este de preferat, deoarece parametrii săi sunt normalizați mai exact și, spre deosebire de uleiul de cedru, nu se usucă pe suprafața lentilei frontale a obiectivului.

Având în vedere cele de mai sus, în niciun caz nu trebuie să utilizați surogate de ulei de imersie și, în special, ulei de vaselină. În unele metode de microscopie, pentru a crește deschiderea condensatorului, un lichid de imersie (de obicei apă distilată) este plasat între condensator și probă.

Obiectiv... Familiarizarea cu dispozitivul de microscop și determinarea rezoluției acestuia.

Dispozitive și accesorii: Microscop, placă metalică cu găuri mici, oglindă iluminatoare, riglă cu scară.

Introducere

Un microscop constă dintr-un obiectiv și un ocular, care sunt sisteme complexe de lentile. Traseul razelor din microscop este prezentat în Fig. 1, în care obiectivul și ocularul sunt reprezentate de lentile simple.

Subiectul AB este plasat puțin mai departe de focalizarea principală a obiectivului F despre ... Obiectivul microscopului oferă o imagine reală, inversă și mărită a obiectului (AB în Fig. 1), care se formează în spatele distanței focale duble a obiectivului. Imaginea mărită este vizualizată de ocular ca o lupă. Imaginea obiectului vizualizată prin ocular, imaginară, inversă și mărită.

Se numește distanța dintre focalizarea din spate a obiectivului și focalizarea din față a ocularului distanța optică a sistemului sau lungimea tubului optic microscop .

Mărirea microscopului poate fi determinată de mărirea obiectivului și a ocularului:

N \u003d N despre  N despre \u003d ───── (1)

f despre  f ok

unde N about și N about - mărirea obiectivului și respectiv a ocularului; D este cea mai bună distanță de vedere pentru un ochi normal (~ 25 cm);  este lungimea optică a tubului microscopului; f despre și f o.K - principalele distanțe focale ale obiectivului și ocularului.

Când analizăm formula (1), putem concluziona că orice obiecte mici pot fi vizualizate la microscopuri cu mărire mare. Cu toate acestea, mărirea utilă dată de microscop este limitată de fenomenele de difracție care devin vizibile la vizualizarea obiectelor care sunt comparabile ca dimensiune cu lungimea de undă lungă a luminii.

Limita de rezoluție microscopul este cea mai mică distanță dintre puncte, a căror imagine în microscop este obținută separat.

Conform teoriei lui Abbe, limita de rezoluție a microscopului este determinată de expresia:

d \u003d ───── (2)

unde d este dimensiunea liniară a articolului în cauză;  este lungimea de undă a luminii utilizate; n este indicele de refracție al mediului dintre obiect și lentilă;  este unghiul dintre axa optică principală a microscopului și fasciculul limită (Fig. 2).

LA se numește cantitatea A \u003d nsin lentilă cu deschidere numerică , iar reciprocul lui d este rezoluția microscopului ... Din expresia (2) rezultă că rezoluția microscopului depinde de diafragma numerică a obiectivului și de lungimea de undă a luminii care luminează obiectul luat în considerare.

Dacă obiectul este în aer (n \u003d 1), atunci la microscop este posibil să se distingă punctele obiectului, distanța dintre care:

d \u003d ─────

Pentru obiectele microscopice, unghiul  este aproape de 90 de grade, apoi sin  1, din care rezultă că într-un microscop este posibil să se examineze obiecte la o distanță de ~ 0,61. În cazul observațiilor vizuale (sensibilitatea maximă a ochiului cade pe regiunea verde a spectrului vizibil   550 nm) la microscop, puteți vedea obiecte situate la o distanță de ~ 300 nm.

După cum rezultă din expresia (2), rezoluția microscopului poate fi mărită prin scăderea lungimii de undă a luminii care luminează obiectul. Deci, atunci când fotografiați obiecte în lumină ultravioletă ( ~ 250-300 nm), rezoluția microscopului poate fi dublată.

Subiect h plasat puțin dincolo de focalizarea frontală a obiectivului. Obiectivul dă real, invers, mărit imagine H’ situat între focalizarea frontală a ocularului și centrul optic al ocularului. Această imagine intermediară este vizualizată prin ocular ca o lupă. Ocularul dă imaginar, direct, mărit imagine H, care se află la cea mai bună distanță de vizibilitate S ≈ 25 cm de centrul optic al ochiului.

Privim această imagine cu ochiul, pe retina sa a real, invers, diminuat imagine.

Mărire microscop - raportul dintre dimensiunea imaginii imaginare și dimensiunea obiectului vizualizat prin microscop:
... Înmulțiți numeratorul și numitorul cu dimensiunea imaginii intermediare H’ :
... Astfel, mărirea microscopului este egală cu produsul măririi obiective de ori de mărirea ocularului. Mărirea obiectivului poate fi exprimat prin caracteristicile microscopului, folosind asemănarea triunghiurilor cu unghi drept
Unde L  optic lungimea tubului: distanța dintre focalizarea din spate a obiectivului și focalizarea din față a ocularului (presupunem că L >> F despre). Mărirea ocularului
... Prin urmare, mărirea microscopului este:
.

4. Rezoluția și limita de rezoluție a microscopului. Fenomene de difracție la microscop, conceptul teoriei lui Abbe.

Limita de rezoluție a microscopuluiz - Aceasta este cea mai mică distanță dintre două puncte ale unui obiect vizualizat la microscop, atunci când aceste puncte sunt încă percepute separat. Limita de rezoluție a unui microscop biologic convențional este în intervalul de 3-4 microni. Rezoluţie microscopul se numește abilitatea de a oferi o imagine separată a două puncte strâns distanțate ale obiectului studiat, adică acesta este inversul limitei de rezoluție.

Difracția luminii impune o limită capacității de a distinge detaliile obiectelor atunci când sunt privite la microscop. Deoarece lumina nu se propagă în linie dreaptă, ci se îndoaie în jurul obstacolelor (în acest caz, obiectele în cauză), imaginile cu mici detalii ale obiectelor sunt neclare.

E. Abbe a sugerat teoria difracției rezoluției microscopului... Fie ca obiectul pe care dorim să-l examinăm la microscop să fie o grilaj de difracție cu un punct d... Apoi, detaliul minim al obiectului pe care trebuie să-l distingem va fi perioada rețelei. Difracția luminii are loc pe rețea, dar diametrul obiectivului microscopului este limitat, iar la unghiuri de difracție mari, nu toată lumina care trece prin rețea intră în obiectiv. În realitate, lumina de la obiect se răspândește la obiectiv într-un anumit con. Imaginea rezultată este cu cât este mai aproape de original, cu atât sunt mai multe maxime implicate în formarea imaginii. Lumina dintr-un obiect se propagă către lentilă dintr-un condensator în formă de con caracterizat prin diafragmă unghiulară tu - unghiul la care obiectivul este vizibil din centrul obiectului luat în considerare, adică unghiul dintre razele extreme ale fasciculului de lumină conic care intră în sistemul optic. Potrivit lui E. Abbe, pentru a obține o imagine a unei rețele, chiar și cele mai indistincte, razele oricăror două ordine ale modelului de difracție trebuie să pătrundă în lentilă, de exemplu, raze care formează centrul și cel puțin prima difracție maximă. Amintiți-vă că pentru incidența oblică a razelor pe rețeaua de difracție, formula sa principală este:. Dacă lumina cade sub un unghi , și unghiul de difracție pentru primul maxim este egal
, atunci formula ia forma
... Constanta de grilare a difracției ar trebui luată ca limită de rezoluție a microscopului
, unde  este lungimea de undă a luminii.

După cum puteți vedea din formulă, o modalitate de a reduce limita de rezoluție a microscopului este utilizarea luminii cu o lungime de undă mai mică. În acest sens, se folosește un microscop ultraviolet, în care micro-obiectele sunt examinate în raze ultraviolete. Structura optică de bază a unui astfel de microscop este similară cu cea a unui microscop convențional. Principala diferență constă în utilizarea dispozitivelor optice care sunt transparente la lumina UV și în caracteristicile înregistrării imaginilor. Deoarece ochiul nu percepe radiațiile ultraviolete (în plus, arde ochii, adică este periculos pentru organul vederii), sunt utilizate plăci fotografice, ecrane luminescente sau convertoare electron-optice.

Dacă în spațiul dintre obiectiv și sticla de acoperire a preparatului este plasat un mediu lichid special numit imersiune, atunci limita de rezoluție este, de asemenea, redusă:
Unde n - indicele de refracție absolut al imersiunii, A – diafragmă numerică obiectivă... Apa este utilizată ca scufundare ( n = 1.33), ulei de cedru ( n \u003d 1.515), monobromonaftalen ( n = 1.66) etc. Pentru fiecare tip de imersie se realizează o lentilă specială care poate fi utilizată numai cu acest tip de imersie.

O altă modalitate de a reduce limita de rezoluție a unui microscop este de a crește unghiul de deschidere. Acest unghi depinde de dimensiunea obiectivului și de distanța de la subiect la obiectiv. Cu toate acestea, distanța de la obiect la obiectiv nu poate fi modificată în mod arbitrar, este constantă pentru fiecare obiectiv și obiectul nu poate fi apropiat. În microscoapele moderne, unghiul de deschidere atinge 140 ° (respectiv, tu/2 \u003d 70 o). Cu acest unghi, se obțin diafragme maxime numerice și limite minime de rezoluție.

Datele sunt date pentru incidența oblică a luminii pe un obiect și o lungime de undă de 555 nm, la care ochiul uman este cel mai sensibil.

Vă rugăm să rețineți că ocularul nu afectează deloc rezoluția microscopului, ci creează doar o imagine mărită a obiectivului.

Articole similare